生鮮畜禽肉中沙門氏菌全基因組分析與分子溯源

宋 晟 高 晗 嚴 禮 郭焜鵬 張海韻 王芳斌

(1. 食品安全監測與預警湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410117；2. 湖南省食品質量監督檢驗研究院，湖南 長沙 410117)

沙門氏菌廣泛分布于自然界，是一種屬于腸桿菌科的革蘭氏陰性桿菌，就邦戈爾沙門氏菌和腸道沙門氏菌這兩個物種而言，迄今就已發現2 500余種血清型。作為一種人畜共患的主要病原菌，沙門氏菌通常會引起發熱、嘔吐等不良反應，是腹瀉病全球四大病因之一[1-2]。某種情況下，沙門氏菌甚至可以進入血液，引發腦膜炎。為治療沙門氏菌病，通常采用抗微生物藥物，但大量抗生素的濫用，導致部分菌株產生耐藥性，使藥物失效[3-4]。人類患沙門氏菌病有可能是食用了被沙門氏菌污染的動物源性食品，如蛋、肉、禽和奶等。對于沙門氏菌以及其他食源性致病菌的溯源研究，主要有傳統的沙門氏菌分離鑒定技術、多位點序列分型(Multi locus sequence typing，MLST)技術以及脈沖場凝膠電泳(Pulsed field gel electrophoresis，PFGE)，近年來，隨著新一代基因組測序技術的發展，基于全基因組測序分子分型技術廣泛應用于食源性致病菌溯源中，具有快速精準等技術優勢[5-7]。

實驗室對長沙市銷售的生鮮雞肉、生鮮豬肉進行了隨機取樣調查，依據GB 4789.4—2016分離、鑒定樣品中的沙門氏菌，以充分了解長沙市銷售的生鮮雞肉、生鮮豬肉的污染狀況，為防治沙門氏菌所引起的食源性疾病提供參考依據，并對分離鑒定出的40株沙門氏菌，進行全基因測序與分子溯源分析，研究其溯源關系、致病機理、耐藥機理，為沙門氏菌基因層面的深入研究提供一定的試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

鼠傷寒沙門氏菌標準菌株ATCC14028：實驗室保存；

生鮮豬肉(24份，每份2 kg)、生鮮雞肉(27份，每份2 kg)：湖南省長沙市各大農貿市場；

緩沖蛋白胨水(BPW)、四硫酸鈉煌綠增菌液(TTB)、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(SC)、HE瓊脂：青島海博生物技術有限公司；

亞硫酸鉍瓊脂(BS)、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂(XLD)、革蘭氏染色液試劑盒(Gram Stain)、三糖鐵瓊脂(TSI)、營養瓊脂(NA)：北京陸橋技術股份有限公司；

革蘭氏陰性菌鑒定試劑卡(GN)：法國Chromagar公司。

1.2 儀器

拍擊式均質器：Masticator Silver型，西班牙IUL公司；

低溫培養箱：MIR-254L-PC型，日本松下電器產業株式會社；

全自動微生物鑒定系統：VITEK 2 compact30型，法國生物梅里埃股份有限公司。

1.3 樣品的采集與處理

將采集的新鮮豬肉24份與整雞27份放入無菌均質袋中，用BPW沖淋后，拍擊式均質器拍擊豬肉2 min，用手搓揉整雞2 min，BPW淋洗液培養18 h。

1.4 增菌與分離培養

吸取1 mL培養18 h的BPW淋洗液，轉種至10 mL TTB中，(42±1) ℃培養24 h，同時吸取1 mL培養18 h的BPW淋洗液，轉種至10 mL SC中，(36±1) ℃培養24 h。從TTB與SC中各挑1環劃線至XLD、BS、HE平板。BS平板與XLD平板(36±1) ℃培養48 h，HE平板(36±1) ℃培養24 h。

1.5 生化試驗

自選擇性瓊脂平板上挑取沙門氏菌典型菌落，接種三糖鐵，(36±1) ℃培養24 h。

1.6 革蘭氏染色

自選擇性瓊脂平板上挑取沙門氏菌典型菌落，經生理鹽水稀釋，涂片固定后，革蘭氏染色，顯微鏡觀察細菌形態。

1.7 鑒定與菌株保存

自選擇性瓊脂平板上挑取典型菌落，接種營養瓊脂(36±1) ℃培養24 h，得到純化單菌落，采用全自動微生物生化鑒定系統進行菌種鑒定。單菌落經營養瓊脂純化后用菌種保存管于-70 ℃保存。

1.8 全基因組測序

對40株沙門氏菌進行基因組DNA的提取、測序、功能基因預測注釋等工作由廣州研科生物科技有限公司完成。

2 結果與分析

2.1 菌株形態、生化鑒定結果

分離獲得的40株典型菌株，在BS瓊脂培養基上，形態為棕褐色或黑色且有金屬光澤，菌落周圍呈黑色；在HE瓊脂培養基上，形態為藍綠色，帶黑色中心；在XLD瓊脂培養基上，形態為粉紅色，帶黑色中心。接種三糖鐵瓊脂，斜面紅色產堿，底層黃色產酸，產H2S瓊脂呈黑色，產氣，瓊脂中有氣泡；經革蘭氏染色，油鏡可觀察，兩端鈍圓的紅色桿菌，革蘭氏陰性，經全自動微生物生化鑒定系統鑒定為沙門菌屬。

24份生鮮豬肉中有20份樣品檢出沙門氏菌，檢出率為83.3%；27份生鮮整雞中有20份樣品檢出沙門氏菌，檢出率為74.1%，說明零售生鮮豬肉與生鮮整雞沙門氏菌的污染率非常高。

2.2 40株沙門氏菌基因組基本信息

采用二代測序技術對40株沙門氏菌進行全基因組測序，并進行序列組裝。由表1可知，豬源性沙門氏菌的scaffold數目在24～71，基因組總長度分布為3 842 688～5 019 323 bp，GC含量平均為54.08%。由表2可知，基因數在4 012～4 382，基因平均長度在932～958 bp。雞源性沙門氏菌的scaffold數目在23～73，基因組總長度分布為4 638 420～5 201 462 bp，GC含量平均為51.93%。基因數在4 016～4 476，基因平均長度在930～959 bp。20株豬源性沙門氏菌基因組總長度的平均值比20株雞源性沙門氏菌基因組總長度的平均值小425 799 bp，而GC平均含量卻比20株雞源性沙門氏菌多2.15%，說明豬源性沙門氏菌與雞源性沙門氏菌在基因組層面存在差異，也暗示兩者來源不同，在運輸與銷售環節的交叉污染可能性小，而飼養、屠宰運輸環節豬與豬之間、雞與雞之間污染可能性大。

2.3 豬源性、雞源性沙門氏菌單拷貝直系同源基因分析

直系同源是指不同物種之間的某一部分序列具有同源性，例如蛋白質的同源性，DNA序列的同源性，而單拷貝直系同源基因是指在不同物種中具有相同序列，相同功能，但基因組中拷貝數為1的基因。單拷貝直系同源基因，大部分為管家基因，在分子系統學中起重要的分子標記作用，通常用于構建生命樹的主干及主干和末梢之間的分枝[8]。分別對20株雞源性沙門氏菌與20株豬源性沙門氏菌的基因組信息進行分析，統計基因家族、單拷貝直系同源基因、多拷貝直系同源基因、獨立旁系同源基因、其他直系同源基因。由表3、4可知，20株豬源性沙門氏菌共有3 988個基因家族，單拷貝直系同源基因數在2 170～2 191，雞源性沙門氏菌共有3 919個基因家族，單拷貝直系同源基因數在2 159～2 183。單拷貝直系同源基因主要包括內肽酶活性基因、水解酶基因、蛋白質分泌調節基因、核糖體結構基因、谷氨酰-tRNA還原酶基因等。

表1 20株豬源性沙門氏菌基因組信息

2.4 基于單拷貝直系同源基因分別構建豬源性、雞源性沙門氏菌系統進化樹

基于單拷貝直系同源基因分別構建豬源性沙門氏菌系統進化樹(見圖1)，結果顯示20株豬源性沙門氏菌明顯聚集為5簇，FC10728、FC11983、FC10743、FC11961、FC11980 5株聚集為1簇，FC10733、FC12045、FC10701、FC10726 4株聚集為1簇，FC10738、FC10718、FC10717 3株聚集為1簇，FC10758、FC11967 2株聚集為1簇，FC10739、FC10745 2株聚集為1簇，另有4株FC10755、FC11958、FC10730、FC10702無明顯聚集。

FC10728、FC11983、FC10743、FC11961、FC11980 5株豬源性沙門氏菌聚集為1簇，但采樣點各不相同，說明該菌種在不同銷售點均存在污染，而污染源可能是來源于同一個屠宰基地或同一個養殖生產基地。FC10733與FC10701聚集為1簇，且來源于同一銷售點，說明銷售點存在交叉污染，或來源于同一供貨渠道。另有FC10707與FC10743，FC11983與FC119582分別來源于2個銷售點，且并不聚集，說明該銷售點所銷售的豬肉存在多株豬源性沙門氏菌污染的情況，可能是不同的供貨渠道所致。從同源性的程度來看，FC10701、FC10726與FC10733同源性極高，分別來源于2個銷售點，FC10717與FC10738同源性極高，分別來源于2個銷售點，FC10728與FC10743同源性極高，分別來源于2個銷售點，FC11961、FC11980與FC11983同源性極高，分別來源于3個銷售點，說明其銷售的豬肉分別來源于同一供貨渠道。

表2 20株雞源性沙門氏菌基因組信息

表3 20株豬源性沙門氏菌直系基因與旁系基因分析

基于單拷貝直系同源基因分別構建雞源性沙門氏菌系統進化樹(見圖2)，結果顯示20株雞源性沙門氏菌明顯聚集為5簇，FC10706、FC10707、FC10731、FC10736、FC11978、FC11982 6株聚集為1簇，FC10721、FC11960、FC11964、FC11987、FC12043 5株聚集為1簇，FC10754、FC11959、FC11988 3株聚集為1簇，FC10729、FC11981 2株聚集為1簇，另有4株FC10712、FC10727、FC10735、FC11951無明顯聚集。

FC10706、FC10707、FC10731、FC10736、FC11978、FC11982 6株雞源性沙門氏菌聚集為1簇，其中FC10706、FC10707與FC10731來源于同一品牌超市的2個分店且同源性極高，說明同一品牌超市的供貨渠道可能存在污染，導致分店銷售的雞肉污染同一沙門氏菌。FC11982與FC11959、FC11988與FC11960分別聚集成不同簇，但來源于同一銷售點，說明該銷售點所銷售的雞肉存在多株雞源性沙門氏菌污染的情況，可能是不同的供貨渠道所致，且存在交叉污染的可能。從同源性的程度來看，FC11960、FC12043、FC11987與FC11964同源性極高，分別來源于4個銷售點，FC10754與FC11959同源性極高，分別來源于2個銷售點，FC10728與FC10743同源性極高，分別來源于2個銷售點，FC10706、FC10707、FC10731、FC10736與FC11978同源性極高，分別來源于4個銷售點，說明其銷售的雞肉分別來源于同一供貨渠道。

表4 20株雞源性沙門氏菌直系基因與旁系基因分析

圖1 基于單拷貝直系同源基因構建20株豬源性沙門氏菌系統進化樹

圖2 基于單拷貝直系同源基因構建20株雞源性沙門氏菌系統進化樹

2.5 豬源性、雞源性沙門氏菌致病基因分析

通過數據比對與分析，發現20株豬源性沙門氏菌，20株雞源性沙門氏菌，共涉及15種致病基因，如表5和表6所示。整體比較而言，雞源性沙門氏菌致病基因較豬源性沙門氏菌多，20株雞源性沙門氏菌共有277個致病基因，而20株豬源性沙門氏菌共有271個致病基因。fimA、fimD、ipaH9.8、ipgD&sopB、K08303、ptrB、sipA&ipaA、sipB&ipaB&bipB、sipC&ipaC&bipC、sipD&ipaD&bipD、yeeJ11個基因為20株豬源性沙門氏菌所共有；fimA、fimD、ipaH9.8、ipgD&sopB、K08303、ptrB、sipA&ipaA、sipB&ipaB&bipB、sipC&ipaC&bipC、sipD&ipaD&bipD、sptP、yeeJ12個基因為20株雞源性沙門氏菌所共有。關于sopE基因，豬源性沙門氏菌中只有FC10730擁有，但雞源性沙門氏菌中有FC10706、FC10707、FC10712、FC10731、FC10736、FC11978 6株擁有該基因。

15種致病基因涉及多種致病機理。fimA，基因注釋為菌毛蛋白，特異性介導細菌對于骨髓源樹突狀細胞的粘附和侵襲作用[9]。fimD，基因注釋為外膜引入蛋白，位于菌毛頂端的蛋白，是所有血清型的共有蛋白，介導沙門氏菌直接粘附宿主細胞。yeeJ，基因注釋為黏附素，介導沙門氏菌對宿主細胞的粘附，對沙門氏菌的定植起重要作用，化學性質方面，黏附素可能為沙門氏菌表面某種特定的蛋白質結構或糖脂成分[10]。sipA&ipaA、sipB&ipaB&bipB、sipC&ipaC&bipC、sipD&ipaD&bipD，基因注釋分別為侵襲素A、侵襲素B、侵襲素C、侵襲素D，4個基因均位于致病島SPI-1，細菌進入宿主上皮細胞的關鍵因子，是沙門氏菌的關鍵毒力因子。ipaH9.8，基因注釋為侵襲質粒抗原，可抑制血小板的正常凝集，促使水腫[11-12]。sopB，基因注釋為磷脂酰肌醇-4,5-雙磷酸4-磷酸酶，是一種肌醇磷酸酶，在發病機理中起重要作用，當沙門氏菌侵入人腸道上皮細胞并分泌sopB蛋白后，將激發3-磷酸肌醇激酶依賴性的信號傳導，從而使腸上皮細胞Cl-水平提高，打亂宿主的多種信號傳導途徑。K08303，基因注釋為蛋白酶，在上皮細胞起信號傳導作用。ptrB，基因注釋為寡肽酶B[13-14]。另有4個致病基因為個別沙門氏菌所有，其中sopE，只有7株沙門氏菌具有，該基因注釋為效應蛋白，可介導肌動蛋白集合，起細菌內化作用；能刺激腸道上皮細胞導致炎癥和腹瀉，促進炎癥細胞的趨化和增殖；破壞宿主細胞的肌動蛋白，進而使得細菌侵入；引起遲發性細胞毒作用，引起黏膜炎癥反應。sopD，基因注釋為效應蛋白，在入侵真核細胞中起協同作用。sptP，基因注釋為效應蛋白，能引起至少兩種蛋白的去磷酸化，抑制肥大細胞的脫顆粒，導致抑制嗜中性粒細胞的聚集，阻止血管內容物流如感染部位，從而引起細菌的全身性感染[15]。TROVE2&SSA2，基因注釋為SS-A / Ro核糖核蛋白，是一種RNA-蛋白質復合體，功能上屬于一種紅斑狼瘡抗原，SS-A / Ro抗體可作為新生兒紅斑狼瘡(NLE)的血清學標志[16]。

2.6 豬源性、雞源性沙門氏菌耐藥基因分析

通過數據比對與分析，發現20株豬源性沙門氏菌，20雞源性沙門氏菌，共涉及15種耐藥基因，如表7和表8所示。整體比較而言，雞源性沙門氏菌與豬源性沙門氏菌的耐藥基因分布情況基本類似，20株豬源性沙門氏菌共有294個耐藥基因，20株雞源性沙門氏菌共有293個耐藥基因。acrA、ampG、ampC&penP、norR、norV、norW、nsrR、ompC、ompF、tolC、YHB1&hmp、lepA、pagP、SIG2&rpoS14個耐藥基因為20株豬源性沙門氏菌所共有；acrA、ampG、ampC&penP、norR、norV、norW、nsrR、ompC、ompF、tolC、YHB1&hmp、lepA、pagP、SIG2&rpoS14個耐藥基因為20株雞源性沙門氏菌所共有，關于vanX基因，分別有14株豬源性沙門氏菌與13株雞源性沙門氏菌有該基因。

15種耐藥基因涉及多種耐藥機制。acrA，基因注釋為膜融合蛋白；TolC，基因注釋為外膜通道蛋白，兩者相互配合，形成主動外排系統，由膜融合蛋白acrA捕獲抗菌藥物后，通過外膜通道蛋白TolC，將抗菌藥物運轉至外界。ompC、ompF，基因注釋為外膜孔蛋白，細菌接觸抗菌藥物后，發生外膜孔蛋白ompC、ompF的表達基因失活，造成孔蛋白丟失或嚴重減少，最終導致β-內酰胺類藥物進入菌體內減少，切斷β-內酰胺類藥物輸入細菌體內的途徑，以產生耐藥性。ampC&penP，基因注釋為β-內酰胺酶，可使使易感抗生素水解而滅活[17]。ampG，基因注釋為β-內酰胺酶感應信號傳感器，編碼一種依賴質子動力勢能的單要素滲透酶，起到向胞漿內傳遞誘導信號的作用。AmpG蛋白是細胞黏肽循環中的關鍵蛋白。若ampG基因缺失，細菌會完全喪失AmpCβ-內酰胺酶的誘導性或只表達低水平誘導[18]。YHB1&hmp、norR、norV、norW、nsrR，基因注釋分別為一氧化氮雙加氧酶、厭氧型一氧化氮還原酶轉錄調節因子、厭氧型一氧化氮還原酶、一氧化氮還原酶FoRd-AND(+)、Rrf2家族轉錄調節因子 & 一氧化氮敏感的轉錄阻遏物，沙門氏菌通過還原一氧化氮，實現對一氧化氮的脫毒，導致吞噬細胞無法殺死沙門氏菌，從而提高沙門氏菌對宿主的抗性[19]。PagP，基因注釋為酰基轉移酶，沙門氏菌細胞外膜的酰基轉移酶PagP，能將磷脂的C16碳脂肪酸鏈轉移到內毒素分子的脂肪酸鏈上，形成次級脂肪酸鏈，PagP產生的內毒素可以干擾TLR4的識別，使沙門氏菌對陽離子抗菌肽產生抗性[20]。SIG2 & rpoS是RNA聚合酶的主要識別因子，當沙門氏菌處于逆境條件下sigma因子啟動調控網，改變其對不同環境壓力的應答，以克服脅迫環境。lepA，基因注釋為GTP結合蛋白，能識別錯誤轉位的核糖體，使其有機會正確轉位。另有vanX為27株沙門氏菌具有，該基因注釋為D-丙氨酰-D-丙氨酸二肽酶，可將細胞胞壁中合成的D-丙氨酰-D-丙氨酸水解，導致細胞壁前質末端的二肽發生結構化變化，從而降低萬古霉素藥物分子跟細菌細胞壁前質的結合力，以獲得對萬古霉素的耐藥性[21]。

表5 20株豬源性沙門氏菌致病基因分析?

3 結論

(1) 長沙市零售的生鮮豬肉與生鮮整雞，沙門氏菌的污染率非常高，如缺乏必要的微生物學知識及防護措施知識，很容易引發交叉污染，發生沙門氏菌食物中毒事件，因此在日常的食品安全監管以及衛生督導工作中，應加強沙門氏菌來源、防護、預防治療的教育工作，消費者也應增強衛生防范意識。

(2) 通過對40株沙門氏菌進行全基因組測序，統計基因家族、單拷貝直系同源基因、多拷貝直系同源基因、獨立旁系同源基因、其他直系同源基因相關信息，并以豬源性沙門氏菌2 170～2 191個單拷貝直系同源基因，雞源性沙門氏菌2 159～2 183個單拷貝直系同源基因，構建系統進化樹，實現了豬源性、雞源性沙門氏菌的全基因溯源。

(3) 通過對豬源性、雞源性沙門氏菌致病基因的預測可知，生鮮畜禽肉中篩選出的沙門氏菌含有多種毒力因子，包括侵襲基因、分泌效應蛋白、黏附素、肌醇磷酸酶、菌毛蛋白、外膜引入蛋白、效應分子，通過協同作用，產生綜合毒力。在基因層面上闡明了沙門氏菌可能存在的致病基因與致病機制，提示了沙門氏菌潛在的致病風險，為藥物研發與疾病治療提供了分子基礎。多個耐藥基因，多種耐藥機制的發現，說明養殖環節可能存在抗生素濫用的情況，加快高耐藥性毒株的產生，因此，農業生產監管部門應加大抗生素使用危害的宣傳力度，加強對養殖戶抗生素使用的監管力度，從源頭減少抗生素的使用，降低對抗生素的依賴。