傷科解毒顆粒微生物限度檢查方法適用性試驗的研究*

韋玉燕，何 科，吳勇梅，王小新，龐云娟

(1 玉林市中西醫結合骨科醫院，廣西 玉林 537000；2 玉林市食品藥品檢驗檢測中心，廣西 玉林 537000)

藥品在生產過程中很容易受到微生物的污染，對患者存在較大的安全隱患。《中國藥典》2015版規定口服制劑必須要進行微生物檢驗。但不同的藥品對微生物存在不同程度的抑制或殺滅作用[1]，因此，《中國藥典》2015年版要求所有要進行微生物限度檢查的藥品都要按照現版藥典要求重新進行相關驗證[2]。本文查閱相關文獻，根據《中國藥典》2015年版相關要求，對我院院內制劑傷科解毒顆粒進行微生物限度檢查方法學驗證，建立符合規定的微生物限度檢查方法，為該制劑的質量控制提供了檢驗依據。

1 材料與儀器

1.1 菌 種

金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌 [CMCC(B)63501]、大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10 104]、黑曲霉[CMCC(F)98003]、白色念珠菌[CMCC(F)98001] 。

1.2 試驗樣品

傷科解毒顆粒(批號：20170718、20170802、20170809)，玉林市中西醫結合骨科醫院。

1.3 儀器與試劑

JJ1000型電子天平，常熟市雙杰測試儀器廠；SHB-1生化培養箱，上海醫用恒溫設備廠；MJ-180B霉菌培養箱，上海賀德實驗設備有限公司；DHG-9006型9246A電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏；BHC-1300HA2生物安全柜，蘇州安春游空氣技術有限公司；YXQ.SG41.280手提式壓力蒸汽滅菌器，上海華線醫用核子儀器有限公司。

胰酪大豆胨液體培養基(批號：170329)，北京陸橋技術股份有限公司；沙氏葡萄糖瓊脂培養基(批號：170526)，北京陸橋技術股份有限公司；麥康凱液體培養基(批號：170313)，北京陸橋技術股份有限公司；胰酪大豆胨瓊脂培養基(170325)，北京陸橋技術股份有限公司；麥康凱瓊脂培養基(批號：160405)，北京陸橋技術股份有限公司；氯化鈉(批號：20150108)，西隴科學股份有限公司。

2 需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數計數方法驗證研究[3-6]

2.1 菌液的制備

按照《中國藥典》2015年版四部要求分別制備金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、黑曲霉等6種菌株的菌懸液，每種菌懸液含菌數均不大于10000 cfu/mL。

2.2 供試液的制備

取傷科解毒顆粒10 g，加無菌胰酪大豆胨液體培養基(TSB)至100 mL，搖勻，即得1:10的供試液。再取1:10供試液適量，用無菌TSB依次稀釋成1:20、1:50、1:100的供試液，備用。

2.3 回收率試驗

試驗組：取“2.2”項下各供試液10 mL置已滅菌的試管中，分別加入“2.1”項下菌懸液各0.1 mL，搖勻，分別取1 mL注入平皿中，加入相應的培養基，放到適宜的溫度下培養，計數。

菌液組：取無菌TSB培養基10 mL數份置已滅菌的試管中，分別加入“2.1”項下菌懸液各0.1 mL，搖勻，分別取1 mL注入平皿中，加入相應的培養基，放到適宜的溫度下培養，計數。

供試品對照組：分別取“2.2”項下供試品溶液1 mL注入平皿中，加入相應的培養基，放到適宜的溫度下培養，計數。

沙氏葡萄糖瓊脂培養基平板在22.5 ℃培養箱中培養5天，胰酪大豆胨瓊脂培養基平板在32.5 ℃培養箱中培養3天。

比值R= (試驗組菌落數-供試品對照組菌落數)/菌液對照組菌落數

根據《中國藥典》2015版四部規定，若比值R在0.5～2范圍內，則可認為該測定方法適合該品種的菌落計數。

2.4 方法驗證[3-6]

2.4.1 預實驗

選用金黃色葡萄球菌、白色念珠菌作為敏感菌株來進行預試驗，結果見表1和表2。

表1 金黃色葡萄球菌預試驗菌回收比值結果Table 1 Recovery ratio results of staphylococcus aureus pre-test bacteria

表2 白色念珠菌預試驗菌回收比值結果Table 2 Recovery ratio results of candida albicans pre-test bacteria

預試驗結果：1:10的供試液(1 mL/皿)組中金黃色葡萄球菌回收比值為0.71，在0.5～2范圍內，表明傷科解毒顆粒對需氧菌沒有抑制作用，采用該方法進行需氧菌總數計數可行；1:10的供試液(1 mL/皿)組中白色念珠菌回收比值為0.75，在0.5～2范圍內，表明傷科解毒顆粒對霉菌和酵母菌沒有抑制作用，采用該方法進行霉菌和酵母菌總數計數應該可行。

根據初試驗結果，初步確定傷科解毒顆粒需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數的計數方法為常規平皿法(1:10供試品溶液1 mL/皿)。

2.4.2 需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數計數方法的驗證

取3批傷科解毒顆粒樣品，需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數均按常規平皿法(1:10供試品溶液1 mL/皿)進行5種菌加菌回收試驗，結果見表3。

表3 3批傷科解毒顆粒回收比值試驗結果Table 3 Test results of recovery ratio of 3 batches of Shangke Jiedu Granules

3批樣品的加菌回收驗證試驗結果表明，胰酪大豆胨瓊脂培養基(TSA)規定的五種試驗菌及沙氏葡萄糖瓊脂培養基(SDA)規定的兩種試驗菌的回收比值均在0.5～2范圍內，表明該方法可以用于傷科解毒顆粒的微生物限度檢查。

3 控制菌檢驗方法的建立與驗證

3.1 大腸埃希菌—增菌液常規法預實驗

陽性菌對照組：取100 mL胰酪大豆胨液體培養基，依次加入“2.2”項制備好的1:10供試液10 mL，“2.1”項中的大腸埃希菌菌懸液10 μL，混勻，即得陽性菌對照組。

陰性菌對照組：取100 mL胰酪大豆胨液體培養基，依次加入“2.2”項制備好的1:10供試液10 mL，“2.1”項中的金黃色葡萄球菌懸液10 μL，混勻，即得陰性菌對照組。

樣品組：取100 mL胰酪大豆胨液體培養基，加入“2.2”項制備好的1:10供試液10 mL，混勻，即得樣品組。

以上三組試液置于30～35 ℃培養箱中培養18～24 h。取培養物1 mL接種至100 mL麥康凱液體培養基中，于42～44 ℃培養箱中培養24～48 h，取麥康凱液體培養物劃線接種于麥康凱瓊脂平板上，30～35 ℃培養箱中培養18～72 h，觀察各平板上的菌落形態。結果見表4。

表4 增菌液常規法檢查大腸埃希菌預試驗結果Table 4 Pre-test results of routine examination of Escherichia coli with enrichment solution

結果表明，采用增菌液常規法檢查傷科解毒顆粒中的大腸埃希菌，方法應該可行。

3.2 大腸埃希菌檢查方法的驗證

取3個批號的傷科解毒顆粒，大腸埃希菌按照增菌液常規法進行加菌驗證試驗，結果見表5。

表5 3批傷科解毒顆粒大腸埃希菌驗證試驗結果Table 5 Validation test results of Escherichia coli from 3 batches of Shangke Jiedu Granules

三批樣品的驗證試驗結果表明，采用增菌液常規法對傷科解毒顆粒的大腸埃希菌的測定進行加菌驗證試驗，符合《中國藥典》2015年版四部1106(非無菌產品微生物限度檢查：控制菌檢查法)的有關規定，方法可行。

4 結 論

(1)蘇潤萍[7]關于驗證方法的選擇做出了優勢優先排序：常規法>稀釋法>中和法>薄膜過濾法>幾種方法聯合使用，因此本文優先驗證常規法。本文采用常規法，驗證了1:10、1:20、1:50、1:100等稀釋級別的菌落回收情況，結果發現1:10的供試液組對藥典規定的5 種驗證菌的回收率均在 50%～200% 范圍內，故認為常規平皿法(1:10供試品溶液1 mL/皿)可用于傷科解毒顆粒的微生物限度檢查。大腸埃希菌常規法驗證時發現陽性菌對照組菌落生長良好，陰性菌對照組沒有菌落生長，表明該品種對大腸埃希菌沒有抑制作用，檢查方法的專屬性好，可用于大腸埃希菌的檢查。

(2)傷科解毒顆粒含有金銀花、蒲公英、青天葵等中藥材，文獻報道這三種中藥材均有較強的抑菌活性，但必須要達到最小的抑菌濃度[8-10]。本實驗結果顯示，傷科解毒顆粒對藥典規定驗證用的5種試驗菌種的抑菌活性較小，考慮可能是一定量的顆粒溶解后未達到最小的抑菌濃度或者是顆粒在制備過程中經過高溫破壞了抑菌活性成分所致。