酶解法提取虎杖中白藜蘆醇的因素研究

錢辰星

(西安交通大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，陜西 西安 710048)

白藜蘆醇作為一種天然多酚類物質(zhì)，廣泛存在于植物界[1-2], 具有多種藥理活性并廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域。目前溶劑提取、超聲提取、酶解法、微波提取、超臨界 CO2萃取等方法[1,3-6]已廣泛用于白藜蘆醇的高效提取。溶劑提取法工藝成熟，但溶劑用量大，耗時(shí)長，提取率低，雜質(zhì)多，不符合綠色化學(xué)理念[7-8,11-12]。超聲提取法，微波提取法和超臨界CO2提取法提取周期短，提取率高，但微波泄露存在健康隱患[4-5,13]，實(shí)驗(yàn)儀器昂貴且實(shí)驗(yàn)條件苛刻，不利于大規(guī)模生產(chǎn)。纖維素酶提取法則有綠色環(huán)保，提取效果好，工藝簡單，成品生物相容性高等優(yōu)點(diǎn)。酶解溫度、酶解液pH 值和酶解時(shí)間對纖維素酶提取白藜蘆醇影響顯著[9-11]。

虎杖具有長久的種植史和多種藥用功效，且富含白藜蘆醇及其衍生物，為高效提取白藜蘆醇提供了可能[8-12,14]：劉樹興與陶明寶等[9-11]等運(yùn)用響應(yīng)面分析與正交實(shí)驗(yàn)對白藜蘆醇的酶法乙醇提取進(jìn)行了纖維素酶用量、酶解時(shí)間、溶劑用量與酶解溫度等因素考察。N,N-二甲基甲酰胺(DMF)作為強(qiáng)極性溶劑，被證實(shí)對生物組織光合色素、輔酶與纖維素成分有較強(qiáng)提取作用[14-16]。而白藜蘆醇酚羥基為強(qiáng)極性溶劑高效提取提供了可行性。本文將在已優(yōu)化白藜蘆醇提取工藝基礎(chǔ)上，采用DMF、乙醇(EtOH)與乙酸乙酯(EtOAc)作為提取溶劑，結(jié)合酶解溫度、溶劑用量探究酶解法提取白藜蘆醇的產(chǎn)率影響因素。

圖1 白藜蘆醇的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The structural formula of resveratrol

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)原理

植物中白藜蘆醇以自由態(tài)和白藜蘆醇葡糖苷2種形式存在，纖維素酶可催化植物體中白藜蘆醇苷在一定條件下酶解脫去一分子葡萄糖，轉(zhuǎn)換成白藜蘆醇并通過對植物細(xì)胞壁的分解破壞增加白藜蘆醇溶出。

酶解后利用有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取，利用高效液相色譜-紫外可見光譜聯(lián)用法在306 nm特征峰處進(jìn)行白藜蘆醇含量測定，推算提取率。

1.2 儀器與材料

SQP型1/1萬電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；PHS-25型酸度計(jì)，上海雷磁儀器廠；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；UPT-I-10T優(yōu)普系列超純水器，成都超越科技有限公司；Agilent 1260 高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；TG20高速離心機(jī)，常州金壇良友儀器有限公司。

白藜蘆醇對照品(11535-200502)，中國藥品生物制品檢定所；色譜純乙腈，德州潤昕實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；虎杖干粉，北京同仁堂有限公司；纖維素酶粉劑(3000 U/g)，東恒華道生物科技有限責(zé)任公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

對于擬探究的四個(gè)因素：酶解時(shí)間、溶劑選取、溶劑用量、酶解溫度設(shè)定三個(gè)不同水平并進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

1.3.2 酸性酶解

精密稱取虎杖干粉1 g，加入60 mg粉狀纖維素酶，重復(fù)配置9組。加入4 mL用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至5.0的蒸餾水。在表1所示的酶解條件下進(jìn)行水浴加熱。

表1 虎杖白藜蘆醇醇提工藝正交實(shí)驗(yàn)因素水平Table 1 Orthogonal test levels of factors associated with polygonum cuspidatum extraction technology

表2 虎杖白藜蘆醇醇提工藝正交實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)安排Table 2 Experiment scheme for orthogonal test

1.3.3 溶劑提取

酶解后的九組樣品在表1所示的提取條件下盡行85 ℃提取2 h。之后將粗產(chǎn)物減壓抽濾，再離心(3000 rpm，10 min)，離心后得提取液。將離心過程重復(fù)三次，得到樣品。

1.4 表 征

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil-C18(200×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相:乙腈-水(30:70)；檢測波長：305 nm；流速：1 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.4.2 對照溶液配制與標(biāo)準(zhǔn)曲線測定

精密稱取白藜蘆醇對照品5.31 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL中含白藜蘆醇212.4 μg的標(biāo)準(zhǔn)溶液。 分別稀釋至原濃度的1/10、1/5、2/5、3/5、4/5、5/5倍精密吸取對照品溶液10.0 μL注入液相色譜儀測定，以峰面積 Y對進(jìn)樣量X(μg)進(jìn)行線性回歸[12]。白藜蘆醇質(zhì)量在2.12～21.2 μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。回歸方程為：

S=7196.35 m+236.12，R2=0.997。

其中S為色譜峰面積(單位為mAU·s)，m為樣品中白藜蘆醇質(zhì)量。

1.4.3 精密度實(shí)驗(yàn)

在1.3.1所述色譜條件下精密吸取同一濃度的白藜蘆醇21.24 μg/mL對照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積積分值，計(jì)算精密度。RSD為0.043%，表明儀器進(jìn)樣精密度良好。

1.4.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一樣品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12 h測含量，結(jié)果樣品在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定，RSD為0.11%，12 h內(nèi)穩(wěn)定性保持良好。

1.4.5 樣品白藜蘆醇含量測定

利用高效液相色譜法進(jìn)行九組樣品每組樣品吸取10 μL的白藜蘆醇提取率鑒定。

1.4.6 計(jì)算提取率

根據(jù)高效液相色譜分析結(jié)果，計(jì)算每組提取率。計(jì)算公式為：

提取率=(總提取質(zhì)量/虎杖干粉總質(zhì)量)×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用極差分析法對正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行因素直觀分析(表3)，可知四種因素對于白藜蘆醇提取率影響顯著性排序?yàn)槿軇┻x擇(D)>酶解溫度(A)>溶劑用量(B)>酶解時(shí)間(C)。通過F檢驗(yàn)判斷不同因素的顯著性大小(表4)。溶劑選擇對于提取率的影響有決定性的顯著性影響作用。最佳條件組合為五號(hào)實(shí)驗(yàn)A2B2C3D1，提取率達(dá)到18.333%，相比于陶明寶[9]等研究中提取率有所提高。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與因素影響順序分析Table 3 Impact order analysis for results of orthogonal test

表4 正交實(shí)驗(yàn)因素顯著水平分析Table 4 Significance analysis for orthogonal test results

2.2 討 論

實(shí)驗(yàn)中酶解溫度以50 ℃最為適合，這與纖維素酶的最適溫度有關(guān)。酸解液-溶劑比控制在1:8能達(dá)到最佳提取率。最佳提取溶劑為DMF。實(shí)驗(yàn)中三種溶劑極性排序和與酚羥基形成氫鍵的強(qiáng)弱順序?yàn)椋篋MF>乙醇>乙酸乙酯，暗示了溶劑選擇對于提取率的影響主要取決于溶劑極性程度，與白藜蘆醇-溶劑的之間氫鍵的強(qiáng)弱。本實(shí)驗(yàn)中DMF的高提取率為其他諸如DMSO，乙腈等強(qiáng)極性有機(jī)溶劑的高提取效率提供了可能。5～10 h內(nèi)提取率與酶解時(shí)間存在不顯著的正向變化，因此短時(shí)間內(nèi)的白藜蘆醇單次提取相比于長時(shí)(通常大于24 h)，多次提取已經(jīng)達(dá)到比較高的提取率。

3 結(jié) 論

提取最佳條件為：取1 g虎杖干粉加入4 mL pH=5的鹽酸溶液，酶解10 h，加入32 mL DMF，85 ℃水浴加熱2 h。其中溶劑選取占據(jù)了決定性因素，同時(shí)酶解時(shí)間也與提取率存在正向關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)相比于耗時(shí)、耗溶劑、提取液液雜質(zhì)含量高且提取率較低的傳統(tǒng)方法溶劑用量少(8倍量DMF)、操作簡便、高效、提取率(1.833%)相對較高。并證實(shí)了DMF作為提取溶劑時(shí)白藜蘆醇提取率存在顯著性上升，為白藜蘆醇的酶解法提取優(yōu)化工藝提供新思路。