高效液相色譜串聯質譜法測定酸奶中木糖和5種低聚木糖含量

甄振鵬，高裕鋒，李碩聰，龐揚海，黃敏興，余構彬，郭劍雄

（廣東省生物工程研究所（廣州甘蔗糖業研究所），國家糖業質量監督檢驗中心，中國輕工業甘蔗制糖工程技術研究中心，廣東廣州510316）

低聚木糖是由2個～7個木糖分子以β-1，4-糖苷鍵結合而成的直鏈低聚糖的總稱，主要包括木二糖、木三糖、木四糖、木五糖、木六糖等[1-3]。低聚木糖具有穩定性好、熱值低等特性，不易被人體消化酶分解，降低了糖分的有效吸收，避免了食用后血糖明顯上升的現象，是糖尿病或肥胖癥患者極佳的甜味劑[4]。同時作為超強雙歧因子，低聚木糖的雙歧因子功能是其他低聚糖的10倍以上，可選擇性促進人體腸道雙歧桿菌的增殖活性，抑制有害菌生長，改善微生物菌群平衡[5-8]。隨著膳食結構的改善，健康意識的提高，低聚木糖因其優越的營養保健功能而備受人們關注。

酸奶是以牛奶為原料，加入蔗糖，經過巴氏殺菌冷卻后，再添加有益菌發酵培養而成的奶制品。在酸奶發酵過程中，經特定菌種作用，奶中蛋白質、糖類等被分解為更小的功能性分子，如氨基酸、乳糖、半乳糖等，同時降低了脂肪含量，提升了脂肪酸含量，提升了人體對營養物質的吸收率，因此酸奶在現代膳食結構中占有重要地位。近年來，酸奶產業發展迅猛，產品類型越來越豐富，功能性酸奶應運而生。功能性酸奶是指在酸奶中添加一定量的特殊營養成分或功能性成分，如低聚木糖等益生元物質，進一步提升營養品質的一類酸奶[9-12]。目前功能性酸奶在行業中屬于較前沿的產品，品類不多，因此相對應的功能性成分監測方法稍有欠缺，尤其是低聚糖方面的檢測方法。多數情況下，檢測方法的欠缺往往會導致監管困難，產品質量良莠不齊的現象，因此開發酸奶中低聚木糖檢測方法，對健全功能性酸奶的質量監管方法，提高功能性酸奶質量監控力度具有重要意義。

目前，食品中低聚木糖的檢測方法有薄層層析色譜法、氣相色譜質譜法以及液相色譜法等[13]。薄層層析色譜法一般只作定性檢測[14]；氣相色譜質譜法需要衍生化前處理[14]，檢測耗時長，且不能檢測單一組分；液相色譜法是目前最常用的方法，有直接檢測法、柱前衍生檢測法和硫酸水解間接檢測法等[15-20]。高效液相色譜串聯質譜法具備定性準確、定量靈敏的優點，因此利用高效液相色譜串聯質譜法開發食品中低聚糖的檢測方法成為了近年來研究的熱點[21-22]。本文將以功能性酸奶為研究對象，優化前處理方法，利用高效液相色譜串聯質譜法開發功能性酸奶中木糖和低聚木糖（木二糖～木六糖）的檢測方法，并在實際應用中對功能性酸奶和普通酸奶進行低聚木糖檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜串聯質譜儀（LC-20AD 4000 Q Trap）：美國應用生物系統公司；超純水器（Milli-Q）：美國密理博公司；振蕩器（Multi reax）：德國海道夫公司；電子天平（BSA224S）：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司。

木糖、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖、木六糖標準品：愛爾蘭Megazyme公司；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）：美國飛世爾公司；有機相濾膜：廣州太瑋生物科技有限公司。

試驗所用的酸奶樣品為市場、網絡平臺中隨機購買的樣品，包括功能性酸奶與普通酸奶。

1.2 標準溶液配制

分別精確稱取木糖、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖、木六糖標準品各10 mg于10 mL容量瓶中，用超純水溶解定容至刻度，將此混合標準儲備液用空白基質提取液逐級稀釋，配成低聚木糖標準品濃度為5.0、2.0、1.0、0.5、0.2、0.1 mg/L 的混合標準溶液。

1.3 分析條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Altus UPLC BEH Amide，1.7 μm，2.1 mm×100 mm；流動相A：0.10%氨水溶液，流動相B：乙腈；梯度洗脫：0～1 min20% A；1 min～5 min 20%～40% A；5 min～10 min 40% A；10 min～11 min 40%～20% A；11 min～13min 20% A。流速：0.25 mL/min；柱溫：40℃；進樣量：10 μL。

1.3.2 質譜條件

電離模式：ESI-；儀器參數：氣簾氣壓力241.1 kPa，碰撞氣壓力中檔，離子噴霧電壓4 500 V，離子源溫度550℃，霧化氣壓力378.9 kPa，輔助加熱氣壓力378.9 kPa；采集模式：多反應監測MRM，具體參數如表1所示。

表1 測定木糖與低聚木糖的質譜參數Table 1 Mass spectrometry parameters of xylose and xylo-oligosaccharides

1.4 樣品處理

稱取酸奶樣品1 g（精確至0.01 g）于10 mL比色管中，加入90%乙醇水溶液定容至10 mL，渦旋振蕩，超聲溶解20 min，全部溶液轉移于50 mL離心管中，以8 000 r/min離心10 min，上清液過0.22 μm濾膜后，取濾液進行高效液相色譜串聯質譜檢測。

2 結果與討論

2.1 色譜和質譜條件選擇

根據木糖和低聚木糖的結構特點，比較了C18色譜柱、HILIC色譜柱、普通硅膠基質氨基柱和新型雜化顆粒專用氨基柱對木糖與低聚木糖的分離效果。結果表明，采用1.7 μm填料孔徑新型雜化顆粒技術專用的氨基柱Altus UPLC BEH Amide，分離效果最好?？紤]木糖與低聚木糖在負離子噴霧模式下進行檢測，加入一定量氨水，能有效提高離子化效率，以乙腈和0.10%氨水溶液作為流動相，調整流動相比例，在10 min內可以實現6種糖的有效分離，如圖1所示。

圖1 木糖與低聚木糖（1.0 mg/L）標準溶液的總離子色譜圖Fig.1 The ion chromatogram of xylose and xylo-oligosaccharides in 1.0 mg/L of standard solution

質譜條件優化方法：以流動注射直接進樣方式下，使用質量濃度1.0 mg/L木糖與低聚木糖標準溶液進行母離子，子離子確認，優化碰撞能量和去簇電壓等質譜參數。

2.2 沉淀溶劑的選擇與優化

木糖和低聚木糖易溶于水，可使用超純水作為提取溶劑。但由于酸奶中富含易溶于水的成分，純水提取對檢測造成很大的干擾。特別是酸奶中富含的蛋白質大分子會產生乳化和吸附作用，干擾質譜檢測，在前處理過程中必須盡量去除。常見的沉淀蛋白質的方法有有機溶劑沉淀法、重金屬鹽沉淀法等[23]。在樣品中分別加入2 mL乙醇、2 mL乙腈、2 mL乙酸鉛溶液，比對試驗了不同蛋白沉淀劑，對加標回收率的影響，結果表明，以乙醇或乙腈作為沉淀劑的效果優于乙酸鉛（圖2）。

圖2 不同類別沉淀劑提取溶劑的回收率Fig.2 Recovery of xylose and xylo-oligosaccharides by extraction solvents with different precipitant

綜合考慮溶劑本身的毒性和價格，確定乙醇作為沉淀劑。進一步考察了不同乙醇濃度（0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%，90%，100%，體積分數）混合溶劑對加標回收率的影響，見圖3。

結果如圖3所示，使用90%乙醇溶液提取時對低聚木糖的綜合加標回收率最優。

圖3 不同乙醇濃度（體積分數）提取溶劑的回收率Fig.3 Recovery of xylose and xylo-oligosaccharides by different extraction solvents with different ratio of ethanol/water

2.3 方法線性范圍和檢出限

用 0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/L 標準工作溶液進樣分析，以響應強度的峰面積為縱坐標，以質量濃度作為橫坐標，繪制標準系列曲線，木糖與低聚木糖標準曲線的相關系數為0.999 5～0.999 7，線性良好。以3倍和10倍信噪比（S/N）確定方法的檢出限和定量限，結果如表2所示，可以滿足木糖與低聚木糖痕量分析的需要。

表2 木糖與低聚木糖的回歸方程、線性范圍、相關系數及檢出限Table 2 Regression equation，liner range，correlation coefficient and detection limit of xylose and xylo-oligosaccharides

2.4 回收率和精密度

準確添加木糖與低聚木糖混合標準溶液于空白酸奶樣品中，在1.0、2.0、10.0 mg/kg 3個添加水平下做6次重復試驗，按方法測定，平均添加回收率在76.5%～88.4%之間，相對標準偏差小于9.8%（見表3），均在允許范圍內，符合試驗要求。

表3 方法的回收率和相對標準偏差（n=6）Table 3 Recoveries and RSD of the method（n=6）

2.5 實際樣品測試

在市場、網絡平臺上隨機購買了30種酸奶，有功能性酸奶與普通酸奶，按照方法進行檢測，見表4。

結果如表4所示，30種酸奶中有10個樣品檢出木糖，含量為1.35 mg/kg～11.85 mg/kg，但標簽并未標注加入木糖；20號樣品標簽中注明添加了低聚木糖，實際檢測結果反映了低聚木糖的實際添加值，也表明該方法可以用于實際樣品測試中。

表4 市售酸奶木糖與低聚木糖檢測結果Table 4 Detection results of xylose and xylo-oligosaccharides in yogurt

3 結論

通過對前處理方法和色譜質譜條件的優化，建立了酸奶中木糖與低聚木糖的高效液相色譜串聯質譜檢測方法。該方法檢出限在0.12 mg/kg～0.54 mg/kg，定量限在0.40mg/kg～1.80mg/kg，回收率在76.5%～88.4%，相對標準偏差小于9.8%，滿足食品檢測分析的要求。該方法簡易、方便、準確，適用于酸奶中木糖與低聚木糖的定量檢測。