野木瓜果汁非酶褐變抑制及營養保全工藝優化

崔霖蕓 羅洪波

(遵義醫藥高等專科學校，貴州 遵義 563006)

野木瓜是薔薇科木瓜屬植物，味酸性溫，具有舒筋活絡、和胃化濕的功效[1]。現代科學研究[2]表明其果實富含多酚、多糖、黃酮、齊墩果酸及多種維生素等生物活性物質。貴州省遵義市正安縣野木瓜因其優良的品質，于1996年被授予“中國野木瓜之鄉”的稱號[3]。野木瓜作為第一批被列入藥食同源的中藥材，除了制成膠囊或片劑藥用外，還被加工成果汁、果脯、軟糖、果酒、果醋等食品，其中果汁是主要產品。

野木瓜果汁在貯藏過程中容易發生非酶褐變，造成產品品質與營養價值降低。因為非酶褐變的反應類型多樣，加工過程中常用復合抑制劑，發揮其不同類型的抑制協同作用抑制褐變。如李鵬等[4]發現0.02%的L-半胱氨酸、0.2%的D-異抗壞血酸鈉和0.01%的亞硫酸氫鈉復合抑制劑能有效抑制柿子汁的非酶褐變；常大偉等[5]發現0.10%抗壞血酸、0.4%β-環糊精和0.08% EDTA對渾濁型梨汁的褐變有較好抑制作用等。而加工中常使用的EDTA及含硫化合物雖然對褐變的抑制效果較好，但不利于身體健康。目前野木瓜果汁非酶褐變抑制的研究尚未見報道。

研究擬以野木瓜果汁非酶褐變抑制率為主要響應目標，將多酚保全率(即抑制褐變后的多酚含量與鮮果汁多酚含量的百分比)和·OH清除率作為次響應目標，應用響應面法對褐變抑制劑的種類及濃度進行工藝優化，以期為提高野木瓜果汁的加工技術水平提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

野木瓜：貴州省遵義市正安縣；

L-半胱氨酸、植酸、D-異抗壞血酸鈉：食品級，純度99%，上海阿達瑪斯有限公司；

檸檬酸、NaCl、CaCl2：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

福林酚：生化級，北京索萊寶科技有限公司；

碳酸鈉、FeSO4、水楊酸、H2O2：化學純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

分光光度計：UV-1801型，北京北分瑞利分析儀器有限公司；

榨汁機：JYZ-V902型，山東九陽股份有限公司;

微波爐：WD900TL23型，廣東順德格蘭仕微波爐有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程

野木瓜鮮果→挑選→清洗→去皮核切塊(1 cm3)→1% NaCl浸泡(5 min)→1.5% NaCl漂燙(100 ℃，30 s)→微波滅酶(800 W，50 s)→榨汁→過濾(100目沙布)→離心(4 000 r/min，3 min取上清液)→添加抑制劑→殺菌(100 ℃，60 s)→趁熱裝瓶→成品

1.2.2 褐變抑制率的測定 在420 nm波長下，測定樣品的吸光度值，以A420 nm值表示該樣品的褐變指數[6]。按式(1)計算褐變抑制率。

I=[(Ai-A0)/A0]×100%，

(1)

式中：

I——褐變抑制率，%；

Ai——添加抑制劑的褐變指數；

A0——未添加抑制劑的褐變指數。

1.2.3 多酚保全率的測定 采用福林法測定多酚含量[7]，按式(2)計算多酚保全率。

P=[(Ci-C0)/C0]×100%，

(2)

式中：

P——多酚保全率，%；

Ci——抑制褐變后果汁中多酚濃度，μg/mL；

C0——鮮果汁中多酚濃度，μg/mL。

1.2.4 ·OH清除率的測定 采用Fenton法[8]，按式(3)計算·OH清除率。

R=[(A0-Ax)/A0]×100%，

(3)

式中：

R——清除率，%；

A0——空白對照的吸光度值；

Ax——加入待測液后的吸光度值。

1.2.5 單因素試驗 據相關文獻[5,9-10]及預試驗結果，選定檸檬酸、氯化鈣、D-異抗壞血酸鈉、氯化鈉、植酸、L-半胱氨酸6種抑制劑，以褐變抑制率為評價指標，考察單一褐變抑制劑的抑制作用。每種抑制劑設置5個濃度梯度[檸檬酸、氯化鈣、D-異抗壞血酸鈉、氯化鈉、植酸分別設定(添加劑在果汁中的質量濃度)0.01%，0.05%，0.10%，0.30%，0.50% 5個梯度，L-半胱氨酸設定0.05%，0.10%，0.40%，0.70%，1.00% 5個梯度]，每次試驗只添加一種抑制劑的一個濃度，不添加其他抑制劑，以考察每種抑制劑的添加量對野木瓜果汁非酶褐變的抑制作用。

1.2.6 Plackett-Burman試驗 以野木瓜果汁褐變度為考察指標，采用單因素試驗確定的檸檬酸、氯化鈣、D-異抗壞血酸鈉、氯化鈉、L-半胱氨酸、植酸的濃度為考察對象，選擇n=12的2水平PB試驗設計。

1.2.7 最陡爬坡試驗 根據PB試驗結果篩選出的因素和效應方向，確定爬坡試驗因素、步長和爬坡方向，設計最陡爬坡試驗方案。

1.2.8 Box-Behnken試驗 根據PB試驗和爬坡試驗選出的顯著因素與水平，應用Design Expert 8.0軟件，設計三因素三水平的Box-Behnken試驗。

1.2.9 數據處理 所有試驗均重復進行3次，取平均值。采用t檢驗判斷數據顯著性。在P<0.05水平設置數據統計學顯著性差異，采用Excel和Design-Expert 8.0軟件進行數據處理。

2 結果與討論

2.1 單一抑制劑對野木瓜果汁褐變的影響

由圖1可知，D-異抗壞血酸鈉和檸檬酸的抑制效果均隨濃度的增加而明顯增加，但在濃度達到0.10%以后，其抑制作用趨于穩定，在0.3%后隨濃度增加抑制下降，D-異抗壞血酸鈉的抑制作用主要是由其在酸性環境中易分解出D-異抗壞血酸[11]，高濃度下抑制效果增加較小甚至下降，可能是因其在高濃度下自身氧化褐變反應加快所致，因此在PB試驗中將其濃度水平定為0.05%～0.10%。檸檬酸的抑制效果隨濃度的增加有明顯增加，但在濃度達到0.10%以后，其抑制效果增加趨于平緩，檸檬酸對非酶褐變的抑制可能是通過降低體系的pH值[7]，此外，檸檬酸有3個羧基，能有效絡合體系中的銅、鐵等金屬離子，研究[8]顯示金屬離子會降低果汁氧化還原電位進而促進褐變，高濃度下抑制效果增加平緩則可能是因其絡合作用使果汁中金屬離子迅速減少，因此在PB試驗中將其濃度水平定為0.05%～0.10%。植酸在低濃度下具有較高褐變抑制率，但隨著濃度增加，抑制率反而降低，植酸的抑制作用可能源于其還原性(能提供6對氫原子與自由基電子形成穩定結構)[12]和6個螯合金屬離子的磷酸根基團，其抑制率隨著濃度的增加而下降可能是由于野木瓜果汁中金屬離子較少，植酸在低濃度下就基本螯合完全，此外植酸濃度的增加使果汁pH值下降，促進抗壞血酸的氧化褐變，有研究[13]顯示在pH值<3.0時，抗壞血酸的氧化褐變隨pH值的下降而上升，因此在PB試驗中將其濃度水平定為0.03%～0.06%。氯化鈣的抑制作用隨濃度增加緩慢增加，在濃度達到0.05%后隨著濃度的增加而緩慢下降，氯化鈣的抑制作用主要是通過鈣離子與氨基酸結合形成不溶性化合物，從而抑制美拉德褐變反應[14]，氯化鈣的抑制作用隨濃度緩慢增加可能是因為野木瓜果汁內氨基酸含量較低，鈣離子作用有限，另外氯化鈣在較高濃度下促進抗壞血酸螯合金屬陽離子而消耗抗壞血酸，使褐變抑制率降低[15]，因此在PB試驗中將其濃度水平定為0.05%～0.10%。氯化鈉的抑制作用隨濃度的增加先增加后下降，可能是氯化鈉在去除野木瓜果汁澀味的同時，消耗了褐變反應物而抑制褐變，此外還能降低果汁內的氧含量，從而降低氧化反應速度而抑制褐變；在較高濃度下氯化鈉也能促進抗壞血酸螯合金屬陽離子而消耗抗壞血酸，使褐變抑制率降低[15]，因此在PB試驗中將其濃度水平定為0.05%～0.10%。

圖1 檸檬酸等5種抑制劑對野木瓜果汁褐變的影響Figure 1 Effects of citric acid and other factors on the browning of Stanuntonia chinensis juice

由圖2可知，L-半胱氨酸對野木瓜果汁褐變具有很強的抑制作用，是試驗所選6個抑制劑中抑制效果最好的。濃度僅為0.05%即可達到30.7%的抑制率，且隨濃度增加而迅速增加，濃度為0.40%時抑制率達到59.5%，隨后增加放緩，在濃度達0.70%后趨于平緩。L-半胱氨酸的抑制效果源于其具有—SH，—SH可以與酚類化合物的氧化產物醌類物質形成無色的羥醌類化合物，從而抑制酚類的非酶褐變反應[16]，因為半胱氨酸中的巰基硫原子極化形成的空d軌道重疊后親核作用增強，在親核加成反應中—SH反應速率比—NH2高200～300倍，使得羰基化合物先與—SH加成從而抑制褐變[17]。鑒于單因素試驗中L-半胱氨酸濃度為0.70%以后，褐變抑制率增加幅度變緩，PB試驗濃度取值為0.40%～0.80%。

圖2 L-半胱氨酸對野木瓜果汁褐變的影響Figure 2 Effects of L-cysteine on the browning of Stanuntonia chinensis juice

2.2 PB試驗

根據單因素試驗結果所確定的PB試驗方案見表1，表中G、H、J、K、L列為虛擬列，用于估計試驗誤差。表2為PB試驗數據的模型方差分析。

表1 Plackett-Burman試驗方案

用Design-Expert 8.0軟件對表1試驗因子進行顯著性分析，得回歸方程(編碼方程)為：

R=63.581+0.618A-2.613B+0.134C-0.893D-1.406E+3.741F。

(4)

由表2可知，回歸模型P=0.004 4，極顯著，說明該回歸方程在回歸區域擬合極好。選取P<0.05的因素，即植酸、D-異抗壞血酸鈉和L-半胱氨酸對結果影響顯著的3個因素。由回歸方程可知，B、E系數為負，即植酸和D-異抗壞血酸鈉為負效應(即低水平影響大，爬坡試驗向下取值)，L-半胱氨酸為正效應(即高水平影響大，爬坡試驗向上取值)。

2.3 最陡爬坡試驗

由表2可知，植酸為負效應，為便于操作，以步長0.005% 向下取值；D-異抗壞血酸鈉為負效應，向下取值，為便于操作，步長取0.01%；L-半胱氨酸為正效應，向上取值，為便于操作，以步長0.10%向上取值，最陡爬坡試驗方案及結果見表3。

表2 Plackett-Burman試驗ANOVA分析

由表3可知，隨著3個顯著因素的變化，野木瓜果汁褐變抑制率呈先增加后減少，最優抑制配比出現在試驗條件5的最佳響應值區域。

表3 最陡爬坡試驗方案及結果

2.4 響應面試驗

根據爬坡試驗結果，應用Box-Behnken設計法，以植酸0.015%、D-異抗壞血酸鈉0.05%、L-半胱氨酸0.90%為中心點，以野木瓜果汁褐變抑制率(權重為0.75)為主響應值、多酚保全率(權重為0.125)、對羥自由基的清除率(權重為0.125)為次響應值加權計算的綜合指標為響應值，設計了三因素三水平的響應面擬合試驗方案見表4，結果見表5。

表4 Box-Behnken試驗方案

通過Design Expert 8.0軟件對試驗結果進行回歸分析，得以下二次多項式方程(代碼方程)：

AI=79.53+0.403A+2.29B-0.50C-0.60AB+0.14AC+0.93BC-1.45A2-1.64B2-0.96C2(R2=0.979 4)。

(5)

擬合方程R2>0.95，說明該方程擬合良好。由表6可知，回歸模型P<0.000 1，極顯著，說明方程模擬很好。從各因素看，L-半胱氨酸對綜合指標達極顯著(P<0.01)，植酸和D-異抗壞血酸鈉對綜合指標均達顯著水平(P<0.05)，說明這3個因素對綜合評價指標作用顯著。

表6 綜合指標方差分析表?

圖3為綜合指標的等高線圖和三維響應面圖。由圖3(a) 可知，植酸和L-半胱氨酸的等高線圖近似橢圓，說明交互作用顯著[18]。植酸的等高線圖為U形，說明植酸在濃度較低時，對綜合評價指標有正效應，但在高濃度時，隨植酸濃度的增加，要達到相同的綜合指標值，需要增加L-半胱氨酸濃度，說明植酸在高濃度時對綜合指標有負效應，與PB試驗結果相符。由圖3(c)可知，植酸和D-異抗壞血酸鈉的等高線圖近似圓形，說明交互作用不顯著，而且植酸和D-異抗壞血酸鈉在濃度較低時對綜合指標有較好的作用，高濃度時二者均需要增加濃度才能維持相同的綜合指標水平，可能是因為隨濃度的增加，D-異抗壞血酸鈉自身氧化褐變反應增強[19]，而植酸濃度的增加降低了果汁pH值而促進抗壞血酸的氧化褐變。由圖3(e)可知，D-異抗壞血酸鈉與L-半胱氨酸等高線圖近似橢圓，說明交互作用顯著。D-異抗壞血酸鈉的等高線圖是向右上方傾斜的，即隨D-異抗壞血酸鈉濃度的增加，要維持同一綜合指標水平，需要增加L-半胱氨酸濃度，說明D-異抗壞血酸鈉在較低濃度下有較好的抑制效果，與前面結果吻合。

通過Design Expert 8.0軟件，得到最優褐變抑制配方為L-半胱氨酸 0.972%、D-異抗壞血酸鈉0.051%、植酸0.015%(均為質量分數)，此條件下，綜合評價指標為80.33。

為了驗證回歸模型的準確度與有效性，按以上抑制劑的最優復合配制條件(為實際操作方便，取L-半胱氨酸 0.97%、D-異抗壞血酸鈉0.05%、植酸0.015%)，進行3次平行實驗，實際檢測抑制率為81.39%，多酚保全率為85.76%，·OH清除率為63.61%，綜合評價指標為80.27，實驗值與驗證值的誤差為0.07%，說明回歸模型較好擬合了最優配方的抑制實驗。

圖3 綜合指標的等高線及響應面圖Figure 3 Contour line and response surface diagram of aggregative indictor

3 結論

通過應用 PB試驗選出單因素試驗中的顯著效應抑制劑和爬坡試驗設計等方法，確定野木瓜汁的最佳復配抑制劑配方為：L-半胱氨酸 0.97%、D-異抗壞血酸鈉0.05%、植酸0.015%。該優化條件下實測的褐變抑制率可達81.39%，多酚保全率為85.76%，·OH清除率為63.61%。

研究雖然證實不使用亞硫酸鹽和EDTA，只用較低濃度且對人體無害的抑制劑就可達到較好的褐變抑制效果，并能夠較好地保全野木瓜果汁的多酚成分和·OH清除功效，但仍需要進一步通過果汁的貯藏試驗確定在貯藏過程中的非酶褐變抑制效果，同時對野木瓜果汁主要成分在褐變中的作用及其反應底物進行研究。在果汁營養保全方面還需對果汁中的其他主要營養成分如氨基酸、多糖等的變化進行研究，并全面測試其抗氧化功效。