超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定外用制劑中非法添加13種抗真菌化學(xué)成分

張艷萍，周宗洲，黃婉鋒，張 敏，何作民，錢(qián) 鑫，關(guān)倩怡

(1.廣東省佛山市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，廣東佛山 528051；2.廣東省佛山市疾病預(yù)防控制中心，廣東佛山 528051)

在人類生活的環(huán)境中，存在很多不同類型的真菌，一旦出現(xiàn)感染，對(duì)于身體的健康會(huì)產(chǎn)生消極的影響，真菌無(wú)孔不入，會(huì)威脅到人們的身體健康和生活工作，真菌感染容易引發(fā)腳氣，體癬，頭癬，甲癬、小兒鵝口瘡，以及女性真菌性陰道炎等各種疾病，對(duì)于這類疾病，一般通過(guò)涂擦抗真菌化學(xué)藥如酮康唑、制霉菌素就能達(dá)到治愈的目的，但隨著生活素質(zhì)的提高，大眾普遍認(rèn)為，抗真菌化學(xué)藥副作用大，純中藥成分制劑副作用相對(duì)較少，因而越來(lái)越受到大家的青睞，而這種心理會(huì)被某些不法生產(chǎn)廠家所利用，這些廠家通過(guò)突顯產(chǎn)品“綠色、健康、純天然”，以及迎合患者急于見(jiàn)效的心理，在生產(chǎn)的純中藥抗真菌外用制劑品種中非法添加含量未知的抗真菌類化學(xué)成分，從而達(dá)到增強(qiáng)療效的作用，雖然在治療疾病上一樣具有療效，但由于其添加的抗真菌類化學(xué)成分種類和含量未知，如果使用者在不知情下長(zhǎng)期大量使用這類產(chǎn)品，會(huì)對(duì)人體的生理代謝產(chǎn)生毒副作用，同時(shí)易引起肝腎損傷，對(duì)人體造成損害。因此加強(qiáng)對(duì)外用制劑中非法添加抗真菌類化學(xué)成分類型及鑒別方法的分析研究，建立外用制劑中抗真菌類化學(xué)成分檢測(cè)方法極為重要，可以進(jìn)一步提高監(jiān)督管理部門(mén)對(duì)流通環(huán)節(jié)中假劣外用制劑的查處率，使制假違法行為得到有效遏制。

目前，關(guān)于抗真菌類化學(xué)成分檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[1-4]，液質(zhì)聯(lián)用法[5-8]，有報(bào)道的液質(zhì)聯(lián)用法同時(shí)測(cè)定抗真菌類化學(xué)成分最多為9種[9]，尚未有本實(shí)驗(yàn)抗真菌化學(xué)成分舍他康唑和氟胞嘧啶的液質(zhì)聯(lián)用法報(bào)道，同時(shí)也尚未發(fā)現(xiàn)用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定本研究的13種抗真菌化學(xué)成分。《中國(guó)藥典》2015年版收載的抗真菌類藥物的檢測(cè)方法也是單一成分的檢測(cè)方法，將單一成分檢測(cè)方法應(yīng)用于監(jiān)管部門(mén)突發(fā)打假抽檢的藥品抗真菌類的檢測(cè)將耗費(fèi)大量的檢測(cè)時(shí)間，并且無(wú)法達(dá)到監(jiān)管部門(mén)要求的快速出具檢驗(yàn)報(bào)告的要求。

采用溶劑提取外用制劑中可能非法添加的咪康唑等13種抗真菌類化學(xué)成分，優(yōu)化色譜參數(shù)和質(zhì)譜參數(shù)，建立同時(shí)測(cè)定外用制劑中非法添加的咪康唑等13種抗真菌類藥物的UPLC-MS/MS 檢測(cè)方法。并將該方法應(yīng)用于抽檢的外用制劑檢驗(yàn)，可快速為監(jiān)督監(jiān)管部門(mén)提供檢測(cè)數(shù)據(jù)，其檢驗(yàn)報(bào)告可作為中藥制劑中非法添加咪康唑等抗真菌類藥物的有效判定依據(jù)。同時(shí)也將更好的應(yīng)對(duì)本地區(qū)藥品監(jiān)督非法添加應(yīng)急檢驗(yàn)工作，為打擊售假、摻假提供科學(xué)技術(shù)依據(jù)，為藥品安全監(jiān)督檢驗(yàn)工作提供技術(shù)保障和支持。

本文采用正離子檢測(cè)模式，多反應(yīng)檢測(cè)，建立同時(shí)測(cè)定咪康唑等13種抗真菌化學(xué)成分的UPLC-MS/MS檢測(cè)方法，進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，并應(yīng)用于外用制劑樣品檢測(cè)。該法簡(jiǎn)便快速、方法靈敏度高，可用于外用制劑的質(zhì)量控制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

美國(guó)Waters xevo TQ三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀，瑞士梅特勒-托利多XPR10電子分析天平，美國(guó)賽多利斯BS 224S電子天平，對(duì)照品氟胞嘧啶(批號(hào) 100315-201502，含量100%)、氟康唑(批號(hào) 100314-201204，含量99.8%)、醋酸氯己定(批號(hào)100183-201003，含量96.9%)、酮康唑(批號(hào) 100294-200602，含量99.9%)、鹽酸萘替芬(批號(hào)100823-200501，含量100%)、克霉唑(批號(hào)100037-200306，含量100%)、伏立康唑(批號(hào)100862-201402，含量99.2%)、鹽酸特比萘芬(批號(hào)100563-201402，含量99.9%)、伊曲康唑(批號(hào)100631-201402，含量99.2%)、硝酸益康唑(批號(hào)100214-201204，含量99.6%)、灰黃霉素(批號(hào)130426-9101，含量99.0%)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，咪康唑(批號(hào)2-AGE-8-1，含量98%)、購(gòu)自TRC硝酸舍他康唑(批號(hào)S0460000，含量100%)、購(gòu)自EP。甲醇、乙腈為色譜純，甲酸為色譜純，水為超純水。供試品為監(jiān)管部門(mén)提供的監(jiān)督抽檢樣品和自行購(gòu)買的網(wǎng)絡(luò)熱銷樣品。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的配制

2.1.1對(duì)照品儲(chǔ)備液

精密稱取各對(duì)照品約4mg于20ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為200μg·mL-1的對(duì)照儲(chǔ)備液。

2.1.2混合對(duì)照品中間液

分別精密吸取氟胞嘧啶、醋酸氯己定、酮康唑各2.00ml；氟康唑、伊曲康唑、灰黃霉素各0.50ml；伏立康唑0.125ml；萘替芬、克霉唑、特比奈酚、咪康唑、舍他康唑0.05ml；益康唑0.025ml至同一20ml容量瓶，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成氟胞嘧啶、醋酸氯己定、酮康唑質(zhì)量濃度為20μg·mL-1；氟康唑、伊曲康唑、灰黃霉素質(zhì)量濃度為5μg·mL-1；伏立康唑質(zhì)量濃度為1.25μg·mL-1；萘替芬、克霉唑、特比奈酚、咪康唑、舍他康唑質(zhì)量濃度為0.5μg·mL-1；益康唑質(zhì)量濃度為0.25μg·mL-1的混合對(duì)照品中間液。

2.1.3混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液的配制

準(zhǔn)確移取混合對(duì)照品中間液適量，配制氟胞嘧啶、醋酸氯己定、酮康唑貝濃度范圍約為0.08～2.0μg·mL-1，氟康唑、伊曲康唑、灰黃霉素濃度范圍約為0.02μg·mL-1～0.50μg·mL-1，伏立康唑濃度范圍為0.05μg·mL-1～0.125μg·mL-1，萘替芬、克霉唑、、特比奈酚、咪康唑、舍他康唑濃度范圍約為0.002μg·mL-1～0.05μg·mL-1，益康唑濃度范圍約為0.001μg·mL-1～0.025μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取固體樣品0.2g或精密量取溶液2.0ml于20mL容量瓶中，加入50%乙腈溶液，漩渦振蕩器振蕩1min,再超聲提取20min,靜置，用50%乙腈溶液定容至刻度，混勻后轉(zhuǎn)移至離心管中，10000r.min-1離心10min，取上清液過(guò)0.22μm濾膜，作為供試品溶液，如果供試品溶液的濃度超出標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍，可用10%乙腈溶液適當(dāng)稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，再進(jìn)行分析。

2.3 色譜與質(zhì)譜條件

2.3.1色譜條件

色譜柱 ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1×100mm，1.7μm)流動(dòng)相為含0.1%甲酸水溶液(A)-0.1%甲酸乙腈溶液(B)，梯度洗脫：0.0～1.0min，90%A；1.0～2.3min，90%A～70%A；2.3～6.0min，70%A～60%A；6.0～7.0min，60%A～50%A；7.0～8.5min，50%A～30%A；8.5～9.5min，30%A～20%A；9.5～9.6min，20%A～90%A；9.6～11.0min，90%A；柱溫：30℃,流速：0.30mL/min,進(jìn)樣量：1μL。

2.3.2質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI)，正離子檢測(cè)，離子源溫度:150℃，毛細(xì)管電壓：3.5KV，脫溶劑溫度：550℃，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)，其各組分質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1，標(biāo)準(zhǔn)TIC圖譜見(jiàn)圖1。

表1 13種化學(xué)成分質(zhì)譜參數(shù)

2.4 線性關(guān)系考察

取混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液各1uL進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果見(jiàn)表2，表明質(zhì)量濃度在規(guī)定的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)大于0.99。同時(shí)將適量混合標(biāo)準(zhǔn)中間液加入不含上述13種抗真菌成分的樣品中，按“2.2”進(jìn)行樣品處理，以信噪比為3∶1時(shí)計(jì)算檢測(cè)下限(LOD)，以信噪比為1∶1時(shí)計(jì)算定量下限(LOD)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 13種化學(xué)成分的線性范圍及相關(guān)系數(shù)等

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液中一濃度1μl,連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰峰面積，計(jì)算13種抗真菌類藥物峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，其結(jié)果分別為4.2%、3.6%、3.4%、2.9%、3.0%、2.5%、2.6%、1.5%、2.2%、3.5%、1.2%、2.3%、1.8%；試驗(yàn)結(jié)果顯示儀器精密度良好。

2.6 回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取6份不含上述13種抗真菌化學(xué)成分的樣品0.20g，添加低、中、高3種不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，按“2.2”進(jìn)行樣品處理，經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果表明：13種抗真菌化學(xué)成分加標(biāo)回收率為87.4%～113.5%，RSD為1.1%～6.9%，均能滿足方法學(xué)要求。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 13種抗真菌化學(xué)成分回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.7 方法應(yīng)用

按照上述建立液質(zhì)方法，對(duì)10批抽樣樣品和網(wǎng)購(gòu)熱銷樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有6批樣品檢出抗真菌類化學(xué)成分，抽檢樣品3批，網(wǎng)購(gòu)樣品3批，其樣品代表圖譜見(jiàn)圖2，樣品具體檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果(mg·g-1)

3 討論

3.1 提取方法優(yōu)化

抗真菌化學(xué)成分一般均能溶于乙腈、甲醇[10-11]，但由于樣品劑型多樣，基質(zhì)成分復(fù)雜，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，部分樣品，特別是膏劑，在純甲醇或純乙腈溶劑未能均勻分撒，可能會(huì)造成非法添加的抗真菌化學(xué)成分無(wú)法完全提取。而用甲醇水溶液或乙腈水溶液則可以避免樣品上述情況，同時(shí)也可以避免液質(zhì)聯(lián)用溶劑效應(yīng)的影響，本文分別考察了不同體積比的甲醇水溶液和乙腈水溶液，發(fā)現(xiàn)采用50%乙腈溶液進(jìn)行提取，基質(zhì)干擾較小，方便快捷。同時(shí)也考察了不同的提取時(shí)間(超聲10min、20min、30min)對(duì)提取效率的影響及整體考慮有些組分的穩(wěn)定性，最終樣品超聲時(shí)間選擇20min。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)嘗試了不能比例的甲酸水-甲醇系統(tǒng)、甲酸水-乙腈系統(tǒng)、甲酸胺-甲醇系統(tǒng)、乙酸銨-乙腈系統(tǒng)溶液等流動(dòng)性組合進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液分離度最佳，各化學(xué)成分峰型較好。本實(shí)驗(yàn)分析了UPLC BEH C18、C8兩款色譜柱的分離效果，發(fā)現(xiàn)C18柱無(wú)論從分離度，峰形等方面都優(yōu)于C8柱，最終選擇C18色譜柱，同時(shí)分析比較了在同一梯度條件下不同柱長(zhǎng)UPLC BEH C18柱的分離效果，雖然短柱分析速度快，但組分咪康唑舍和他康唑完全重合，未能達(dá)到分離要求，因此選擇柱長(zhǎng)為100mm的C18色譜柱。

3.3 樣品檢測(cè)結(jié)果分析

應(yīng)用本方法對(duì)10批外用制劑進(jìn)行了分析測(cè)定，1批次檢出酮康唑和咪康唑，含量分別為0.2mg·g-1、11.3mg·g-1，1批次檢出咪康唑和特比萘芬含量分別為10.9mg·g-1、2.0mg·g-1,4批次檢出咪康唑，含量分別為26.7mg·g-1、32.3mg·g-1、6.4mg·g-1、18.1mg·g-1。從結(jié)果可知，在外用制劑中抗真菌類成分檢出率非常高，特別是咪康唑，10批樣品中有6批樣品中檢出，咪康唑是高效、安全、屬于咪唑類廣譜抗真菌藥，對(duì)致病性真菌幾乎都有作用，廣泛用于如頭癬、手癬、腳癬、但其具有較強(qiáng)的毒副作用和耐藥性，盲目使用對(duì)患者身心健康有較大影響。從檢測(cè)結(jié)果可知，外用制劑膏劑中添加抗真菌類化學(xué)成分非常嚴(yán)重，部分膏劑屬于消字號(hào)外用制劑，其本應(yīng)只具有皮膚清潔，衛(wèi)生和消毒作用，并不具有藥物的治療功效，而且沒(méi)有經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的藥品試驗(yàn)論證，其不良反應(yīng)并不明確，這類產(chǎn)品被不良生產(chǎn)廠家宣傳為“純中藥配方”，卻暗地里大量添加化學(xué)成分，消費(fèi)者長(zhǎng)期使用后很可能導(dǎo)致嚴(yán)重后果，希望能引起有關(guān)監(jiān)管部門(mén)的重視，保障市民用藥科學(xué)、安全有效。

本研究所建立的方法可同時(shí)用于外用制劑中可能非法添加的13種抗真菌類化學(xué)成分的定性篩查和定量分析，在10min中內(nèi)完成了對(duì)所有化合物的分析測(cè)定，在保證分離的情況下，實(shí)現(xiàn)了快速有效的高通量分析，檢測(cè)的化合物較為全面，可為監(jiān)測(cè)外用制劑中非法添加抗真菌藥物提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持。本分析方法靈敏，精密度高，回收率好，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方法能很好的排除復(fù)雜制劑中背景干擾，結(jié)果準(zhǔn)確、真實(shí)，可作為分析添加違禁藥物的有效手段，為打擊外用制劑的制假行為，提供了有利的技術(shù)保障。