市售載玻片涂制瘧原蟲檢測血涂片質量的比較

呂全 孫曉東 許時燕

在臨床醫學中，血涂片的顯微鏡檢查是血液細胞學檢查的基本方法[1]，對多種血液疾病的診斷具有重要價值[2]。血涂片鏡檢法迄今仍是瘧疾診斷最直接可靠的方法[3]，是瘧原蟲檢測金標準[4-5]，也是我國消除瘧疾行動計劃推薦瘧疾診斷方法[6]。但是，血涂片的制備和染色不良，常使細胞形態結構鑒別發生困難，甚至導致錯誤結論。WHO建議正在消除瘧疾的國家應維持有質量保證的瘧原蟲鏡檢能力[7]，《瘧原蟲檢測 血涂片鏡檢法（WS/T 569—2017）》行業標準[8]的頒布，為瘧原蟲檢測的血涂片制作與染色提供了統一的標準[5，9]，但未詳細規定載玻片的清潔標準，載玻片清潔與否從而成為影響瘧原蟲鏡檢質量的關鍵環節。為了解市售不同預清潔載玻片涂制血涂片的質量，為保障瘧原蟲鏡檢質量提供科學依據，2018年9月開展本項研究，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

（1）血樣。實驗前用肝素鈉真空采血管采集1名研究者靜脈血2 mL，采血管上下顛倒5次混均抗凝劑。

（2）載玻片。在互聯網上查閱或咨詢不同廠家和不同品牌載玻片的預清潔資料，收集市售不同預清潔新載玻片各50張。

1.2 研究方法

（1）對照載玻片。從本實驗室庫存的清潔級（clear glass）載玻片隨機抽取20張浸入有洗潔精的清水中浸泡30 min，用脫脂紗布逐一擦拭后用清水沖洗干凈，晾干后再用脫脂紗布將載玻片擦亮作為對照載玻片。

（2）血涂片制作。收集的每種載玻片各隨機抽取20張以及對照載玻片20張，用定量移液器取血1 μL為薄血膜血量，取4 μL為厚血膜血量，由本實驗室1名瘧疾專業技術人員按國家標準[8]用推片逐一涂制瘧原蟲檢測血涂片，其中厚血膜涂成直徑1 cm圓形，薄血膜涂成寬2 cm×長2.5 cm舌型，每片血涂片用記號筆標記載玻片預清潔等級和編號。

（3）血涂片染色。吉姆薩染液原液和pH7.2磷酸鹽緩沖液由本實驗室提供。血涂片自然陰干和薄血膜用甲醇溶液固定后，按國家標準規定的成批血涂片染色法[8]，用10槽玻璃染色缸加入2%吉氏工作液背靠背的染色20張血片，30 min后沖洗晾干。

1.3 觀察指標

2人盲法觀察每張染色血涂片，分別計數厚薄血膜上的針孔空洞數（空洞直徑＜0.5 mm）,油斑空洞數（空洞直徑明顯較針孔空洞大或直徑≥0.5 mm）和血膜脫落數，計數結果記錄在登記表。

1.4 統計學方法

用EXCEL 2010建立數據庫，用SPSS 17.0軟件進行描述性統計分析，油斑空洞計算載玻片出現率以（%）表示，不同載玻片針孔空洞數進行正態性檢驗和方差齊性檢驗后用t檢驗分析差異顯著性，顯著水平α=0.05。

2 結果

2.1 載玻片

共收集4種載玻片，100%為即用型預清潔載玻片，預清潔等級分為清潔級（clear glass）、標準級（standard grade）、超級（super grade）和病理級（pathology grade）。

2.2 質量觀察

共染色100張血涂片，其中4種預清潔和對照載玻片共5種載玻片各染色20張。100張染色血涂片中，累計97張出現335個針孔空洞，3張對照載玻片未出現空洞，針孔空洞總出現率為97%（97/100），平均（3.35±1.77）個；5種載玻片涂制的血涂片針孔空洞數均呈正態分布（P＞0.05），方差齊（P=0.203），5種載玻片針孔空洞數間比較差異有統計學意義（P＜0.01）；4種預清潔載玻片涂制的血涂片針孔空洞數均多于對照載玻片，比較差異均有統計學意義（P＜0.01），其中超級清潔載玻片針孔空洞平均數最高（4.85±1.57）個。2張超級清潔載玻片涂制的血涂片分別出現油斑空洞1個和3個，空洞直徑均＜1 mm。油斑空洞總出現率為2%（2/100）。血膜脫落率為0。血涂片質量觀察結果見表1。

3 討論

用顯微鏡觀察標本時用來放標本的玻璃片通常稱為顯微載玻片,其分類方法眾多,例如，按是否預清潔分為免洗載玻片和未免洗載玻片，按是否防脫分為普通載玻片和黏附載玻片，按能否做記號分為記號載玻片和普通載玻片，以及磨砂邊和拋光邊等。本研究中，筆者參照瘧疾臨床診斷和監測的實際應用而收集普通顯微載玻片，100%為即用型預清潔載玻片，其預清潔等級是按玻片盒上中文或英文標注歸類為清潔、標準、超級和病理級4種預清潔等級，但其清潔分級標準未查閱到相關文獻和資料。

WHO建議選擇質量好的載玻片來涂制瘧原蟲檢測血涂片[10]，而霉變、灰塵和油污等低質量載玻片將導致血膜脫落、涂片和染色質量差，從而影響瘧原蟲鏡檢質量，載玻片無論預清潔與否，涂制血涂片前必須清洗清潔和分包保存。然而我國新近頒布實施的《瘧原蟲檢測 血涂片鏡檢法》（WS/T 569—2017）國家標準未對載玻片的清洗清潔做詳細的規定，僅要求載玻片為無劃痕無油污的潔凈載玻片[8]。本研究收集到的4種載玻片100%為預清潔免洗載玻片，其中病理級載玻片采用塑料袋真空包裝，防霉效果略好于其余3種用塑料薄膜包裝載玻片。

針孔空洞普遍存在于薄血膜，肉眼觀察薄血膜常見細小的空洞無規律的分布于薄血膜，偶見厚血膜。研究發現血涂片針孔空洞出現率為97%，平均（3.35±1.77）個，甚至用洗潔精清洗過的對照載玻片出現率也高達85%（17/20），但清洗過的載玻片針孔空洞數明顯少于未清洗載玻片（P＜0.01），平均（1.75±1.12）個。研究同時發現僅針孔空洞數最多的超級清潔載玻片出現油斑空洞（10%），說明針孔空洞和油斑空洞均與載玻片上的油污有關，針孔空洞數越多，油斑出現的概率越大，而常用的洗潔精浸泡清洗方法不能完全清除載玻片表面油污。顯微鏡油鏡下觀察薄血膜油斑空洞周圍紅細胞堆積變形明顯，這在瘧原蟲檢測時會影響瘧原蟲蟲種判定和密度計數[10]，而針孔空洞周圍紅細胞重疊不明顯，不影響鏡檢質量也不影響薄血膜整體外觀。本研究隨機抽取的100張載玻片未發現明細劃痕，染色的厚薄血膜也無血膜脫落。因此，新載玻片在未清洗清潔的情況下，除了超級清潔級載玻片外，其余3種預清潔載玻片涂制的瘧原蟲檢測血涂片滿足消除瘧疾臨床診斷和監測質量要求。

表1 不同預清潔載玻片涂制瘧原蟲檢測血涂片質量比較

血膜制作和染色是影響瘧原蟲鏡檢質量的關鍵因素[11-12]，但隨著即用型載玻片應用，臨床檢驗中往往忽略了玻片質量的把關[13]。本研究發現市售的顯微載玻片大部分預清潔質量尚可，在現場工作中可根據針孔空洞數和油斑空洞數預判載玻片的清潔質量，一旦出現油斑空洞，該批載玻片建議清洗清潔后再用于涂制血涂片，而用于制作教學和瘧原蟲血涂片資源庫儲存時，新載玻片建議須清洗清潔，但清洗方法尚需改進。