分光光度法測定食用植物油中的總黃酮含量

王冠霖， 肖 坤， 許 旭

(上海應用技術大學 化學與環境工程學院， 上海 201418)

我國是一個油料進口大國，各類食用油及原料進口數量較大[1]，增加食用油供應并改善其品質是需要解決的重要議題之一[2]。黃酮類化合物廣泛存在于各類植物中，具有抗腫瘤、抗心血管疾病、抗炎、提高免疫力、抗病毒、抗氧化等藥理學活性[3-5]。不同植物中的黃酮成分存在差異[6-7]，對食用植物油的營養和使用有一定影響，可為區分不同食用油及其摻假提供依據；測定食用植物油中的總黃酮含量也可為進一步研究其中的黃酮成分種類和含量奠定基礎。

分光光度法常用于總黃酮的測定[8]，在中性或弱堿性及亞硝酸鈉存在條件下，黃酮類化合物與鋁鹽生成絡合物，在堿性條件下顯色,可用于定量分析總黃酮含量。張志華等[9]直接用該法測定了玉米油中的總黃酮。但在食用油分析時，在處理油脂樣品時存在一定困難。余旭亞等[10]用無水乙醇稀釋后測定了核桃油中的總黃酮。張志英等[11]利用60%甲醇溶液對山茶油樣品進行萃取，經氮吹、復溶后，測定山茶油中黃酮含量為(8.98±0.54) mg/kg(以蘆丁計)。Zheng等[12]通過固相萃取處理樣品，氮吹、復溶后，測定不同制取工藝制作的各沙棘油樣品，其中總黃酮含量約為4.11～14.18 mg/100g(以槲皮素計)。實驗中，油脂樣品在不同的前處理時仍然存在乳化或者大量稀釋的問題，影響后續的分光光度法測定。因此，食用油中黃酮分析的樣品預處理方法仍然是需要研究的問題。

本文提出用氫氧化鉀乙醇溶液皂化食用油的樣品處理方法，使食用油樣品和反應試劑的各種溶液可以充分混合互溶，有利于實現更準確靈敏的總黃酮檢測分析，并實際用于食用油樣品中總黃酮的分析。

1 材料與儀器

TU-1901型紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)；Nicolet iN10型紅外光譜儀(美國Thermo-Fisher公司)；正己烷、乙酸乙酯、三油酸甘油酯、無水乙醇、蘆丁、氫氧化鉀、亞硝酸鈉、九水硝酸鋁、硅膠(100～200 目)等均為國產分析純試劑。叔丁基對苯二酚(TBHQ，含量98%+)、豆甾醇(含量95%)、茶多酚(50%)均為Adamas產品。活性白土購自上海九潔實業有限公司。實驗用水為屈臣氏蒸餾水。食用油樣品(福臨門一級大豆油，魯花壓榨玉米油)均購自本地超市。

2 實驗方法

2.1 蘆丁標準溶液及其他溶液的配制

蘆丁標準溶液：精密稱取蘆丁 0.027 7 g超聲溶于乙酸乙酯，并定容至100 mL。

氫氧化鉀-乙醇溶液：稱取6.4 g氫氧化鉀溶于100 mL的95%乙醇中。

4%亞硝酸鈉溶液、4%九水硝酸鋁溶液：各稱取2.0 g試劑分別溶于50 mL的80%乙醇水溶液中。

2.2 作為溶劑的脫色油樣處理

取大豆油50 mL加入50 mL正己烷混勻，取除去填料的固相萃取空柱管(上海安譜實驗科技股份有限公司)一支，加入清洗烘干后的硅膠(粒徑75～150 μm，100～200目)制作柱長約為5～7 cm的硅膠柱，將混勻的油樣常壓通過硅膠柱，再用一支同樣自制的6～8 g活性白土柱對流出液在10 mL/min流速下進行二次吸附。得到的溶液蒸干除去正己烷待用。其中的總黃酮含量用標準加入法測定。

2.3 皂化反應

取6個10 mL離心管，向其中各加入2.2中脫色油樣500 μL，依次加入0(不加)、200、400、600、800、1 000 μL蘆丁標準溶液，渦旋混合30 s。放入80 ℃水浴中，分別加入氫氧化鉀-乙醇溶液 1 000 μL，保持熱80 ℃水浴15 min。

2.4 顯色反應

向2.3所述離心管中加入500 μL質量濃度為4%的亞硝酸鈉水溶液，震蕩，水浴6 min后，加入500 μL質量濃度為4%的九水合硝酸鋁水溶液，震蕩混勻，水浴6 min，此時溶液會有大量白色沉淀，向其中加入2 mL氫氧化鉀-乙醇溶液，搖勻后，取出離心管冷至室溫，此時溶液為黃棕色透明澄清液體。加入氫氧化鉀-乙醇溶液定容后至10 mL，溶液中殘留少許白色沉淀不影響測定。離心后取上清液用紫外分光光度計，在波長353 nm處，以無水乙醇為空白，測各溶液的吸光度，用含蘆丁溶液(加上標準加入法測定的脫色油樣中總黃酮含量作為濃度值)測定的吸光度得到標準曲線方程。

2.5 樣品吸光度測量與含量測定

選取λ=353 nm作為測量波長。直接吸取 1 000 μL油樣至10 mL容量瓶，按上述2.3從“放入80 ℃水浴中”開始，以及2.4的步驟，至測定吸光度。同一樣品重復取樣3次平行測定，根據2.4中得到的標準曲線方程，算出食用油樣品中總黃酮的含量。

3 結果與討論

3.1 樣品前處理方法選擇

實驗中樣品為食用油，疏水性強且黏度高，嘗試按照文獻方法[9-10]直接或者稀釋后加入亞硝酸鈉進行顯色反應時，溶液有部分呈乳濁狀態，難以進行分光光度測定。考慮到文獻中的方法比較復雜[11]、或需要大量稀釋[12]，且黃酮化合物在堿性條件下較為穩定，故嘗試將食用油樣品皂化。比較不同的皂化條件，在使用氫氧化鉀的95%乙醇溶液，水浴80 ℃條件下15 min，油樣皂化后可以充分溶解在乙醇中，溶液保持透明且與后續顯色溶液互溶，沒有出現乳化問題，可用于后續的顯色實驗和分光光度測定。故選擇氫氧化鉀-乙醇溶液為前處理皂化反應堿液。

3.2 標準溶液配制

實驗中使用水、甲醇、三油酸甘油酯作為溶劑配制蘆丁標準溶液并進行比較。結果，三油酸甘油酯由于顏色深影響吸光度測定，水溶液由于和食用油反應體系差異較大造成吸光度測定存在明顯偏差，使用甲醇溶液則幾乎不發生顯色反應。考慮到與食用油樣品一致，最后采用脫色后的食用油加入蘆丁乙酸乙酯溶液為標準溶液。

實驗中嘗試過硅膠、活性白土、凹凸棒土、沸石、活性炭等作為吸附脫色劑對食用油進行脫色處理，結果單一使用以上1種脫色劑效果不佳，而采用硅膠脫色加活性白土二次脫色后的食用油能基本脫除顏色，且吸光度測量結果顯示，測量值與加入值相近，該法脫色后的食用油黃酮含量較低，易于配制所需濃度范圍的標準溶液。

3.3 實驗條件選擇

波長選擇。以無水乙醇為參比，在TU-1901型紫外可見分光光度計上直接掃描300～800 nm范圍內標準溶液和待測溶液的吸收光譜，吸收峰值均在λ=353 nm左右且該波長附近吸光度變化較小，故實驗選取λ=353 nm作為測量波長。

皂化及顯色實驗溫度。為方便實驗，兩者使用了相同的水浴溫度。比較了室溫、50 ℃水浴、80 ℃水浴、沸水浴，結果表明室溫及50 ℃水浴條件下皂化反應及絡合顯色反應進行較慢，而沸水浴加熱條件下會使乙醇大量蒸發導致溶液出現分層現象，故選擇80 ℃水浴。

顯色反應溶劑。嘗試使用亞硝酸鈉及硝酸鋁的水溶液，但在加入含有乙酸乙酯的蘆丁標準溶液和脫色油樣后，仍然會發生可見的溶液分層。選擇含水乙醇溶解顯色試劑可以避免分層現象。

水浴過程中加入硝酸鋁溶液后出現了白色沉淀物質，在加入乙醇定容后也會出現少量白色沉淀，取這些白色沉淀用紅外光譜儀分析，經標準譜圖檢索對比，兩種沉淀均主要為氫氧化鋁。嘗試將沉淀復溶于乙醇-水中，在實驗選定的353 nm波長處測定吸光度為零，可以認為沉淀中不含黃酮類化合物及其顯色成分。考慮到最終的沉淀物較少，故用無水乙醇定容混勻后離心，取上層清液測定。

通常可使用不加蘆丁標準溶液的脫色油樣顯色溶液作為參比溶液測定吸光度。實驗中，以無水乙醇為參比溶液，測定的該不加蘆丁標準溶液的脫色油樣吸光度值一直很穩定，說明可以用無水乙醇為參比溶液。為方便實驗，本法建議使用無水乙醇為參比，并測定不加蘆丁標準溶液的脫色油樣顯色后的吸光度，以便評價脫色油樣的可靠性。

3.4 方法認證

3.4.1 精密度

取大豆油樣品，按照2.3的峰方法重復處理并測定吸光度，考察其日內精密度、日間精密度。結果表明，測得的日內精密度的相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)為0.82%，日間精密度RSD為1.8%。

3.4.2 脫色油樣中總黃酮的標準加入法測定

在波長λ=353 nm處，以無水乙醇為參比溶液，通過在脫色溶液中加入不同量的黃酮(蘆丁)標準溶液，測定其添加蘆丁濃度對吸光度的擬合曲線方程為y=0.147 6x+0.205(相關系數R2=0.996 5)，按標準加入法計算得到該脫色溶液中的總黃酮含量為1.39 mg/L，該濃度遠低于大豆油樣品中黃酮的含量，可用于配制標準溶液。

3.4.3 線性與標準曲線

根據3.4.1的結果，將各標準溶液濃度中蘆丁濃度加上脫色油樣的濃度1.39 mg/L，作為黃酮標準溶液濃度與吸光度擬合，得到標準曲線線性方程y=0.147 6x+0.000 03，相關系數R2=0.996 5。

3.4.4 干擾成分考察

考察了食用油中存在的其他成分對本法的影響。結果表明，加入10%的甘油三酯類成分(除其本身顏色外)對顯色反應沒有影響，而且實驗中使用的脫色油樣中主要成分即為甘油三酯。按照2.2的方法將蘆丁依次更換為1～2 mg/mL 的TBHQ(叔丁基對苯二酚，常用的食用油添加劑)、豆甾醇、茶多酚進行顯色反應，吸光度均與不加的空白樣品相同。如食用油中存在1～2 mg/mL的抗氧化劑、甾醇、多酚類成分，這幾種成分對本法沒有干擾。

3.4.5 回收率

取大豆油樣品，按照2.3的方法測定并根據標準曲線計算總黃酮的含量，在同批次樣品中加入精確稱取的蘆丁標樣，同步進行顯色反應，并對其總黃酮含量進行測定。計算方法的回收率見表1。可見，脫色油樣中的濃度遠低于實際植物油樣品中的濃度，說明本法使用經標準加入法測定黃酮含量的脫色油樣制備標準溶液是可行的，且不會影響測定的準確度。

表1 加標回收率和相對標準偏差(n=3)

3.5 實際樣品測定

取大豆油和玉米油樣品，按2.3的方法平行測定3次，根據標準曲線計算總黃酮的含量，結果玉米油樣品中總黃酮含量為(10.11±0.04) mg/L，大豆油樣品中總黃酮含量為(13.06±0.09) mg/L。

4 結 語

建立了食用油樣品皂化后顯色-分光光度法測定總黃酮含量的方法。以蘆丁為黃酮類成分的標樣，樣品和標樣經皂化、鋁鹽絡合顯色，在353 nm波長測吸光度并根據標準曲線計算含量。已知的食用油主要成分對本法沒有干擾。本方法通過對樣品的皂化處理，避免了使用文獻方法時實驗過程中的乳化現象、及其對吸光度測定的干擾，具有較好的精密度和準確度，且操作簡便，已用于大豆油和玉米油實際樣品的測定。