藍藻胞外多聚物生物合成、群體形成與微囊藻水華

邱東茹

(中國科學院水生生物研究所, 武漢 430072)

隨著我國社會經濟的迅速發展和城市化進程加速, 大量工業生產廢水、城鎮生活污水和農業面源污染帶來的氮和磷等營養元素進入河流湖泊和近海水體, 水體富營養化進程加速。藻類水華和赤潮頻繁發生, 嚴重影響多個大中城市飲用水供水安全及水產養殖等其他水體功能[1], 污染型缺水問題愈演愈烈。近幾年有毒微囊藻(Microcystis)水華在江蘇太湖、安徽巢湖和昆明滇池的頻繁大規模發生引發全社會的關注和政府的高度重視。微囊藻毒素具有肝毒性和致癌性高、穩定性高、可生物積累和生物放大的特性, 對公眾健康帶來嚴重的危害和潛在風險。近年來我國學者對微囊藻水華暴發機理進行深入研究, 并試驗了一系列控制的物理、化學和生物措施, 取得了可喜的進展, 但形勢依然嚴峻。另一方面, 某些富營養化湖泊如武漢東湖藍藻水華卻突然消失并很少復發。20世紀80年代中期武漢東湖持續10余年的微囊藻水華突然消失, 此后雖然水體污染有增無減, 主體湖區卻沒有發生大規模藍藻水華。我所淡水生態學家劉建康院士認為可能歸因于東湖大水面放養鰱、鳙等濾食性魚類。此后劉建康院士和謝平研究員用生態圍隔進行實驗湖沼學研究, 證實濾食性魚類的濾食對微囊藻水華的控制作用[2]。藍藻水華生物防治的可能途徑包括生物操縱(Biomanipulation, 如鰱、鳙魚濾食藍藻)、利用溶藻細菌(Algicidal bacteria, 或稱algae-lysing bacteria)和藍藻噬藻體(Cyanophage)來控藻等[3,4]。我們試圖基于在活性污泥菌膠團形成菌中的研究結果, 從藍藻群體形成及其可能的分子機制出發, 探討微囊藻水華形成的分子機理和防治對策。

1 胞外多聚物與藍藻群體形成

能形成水華的微囊藻和魚腥藻等常見藍藻是原核生物, 又稱之為藍細菌(Cyanobacterium), 其細胞結構屬于革蘭氏陰性菌型, 即具有細胞外膜(Outer membrane), 由少數肽聚糖層組成的細胞壁位于細胞外膜與細胞質膜(Cytoplasmic membrane,或稱內膜Inner membrane)之間的周質空間內, 受到保護, 不易受到溶菌酶的攻擊。與許多革蘭氏陰性細菌一樣, 藍細菌(藍藻)也大量合成胞外多聚物(Extracellular polymeric substance, 縮寫為EPS),主要是胞外多糖, 形成包裹在細胞外的莢膜(Capsule)、膠鞘(Sheath)和黏液層(Slime layer), 其中黏液層容易脫落; 莢膜和膠鞘則與細胞緊密相連。許多微囊藻細胞的胞外膠狀物質共同形成公共莢膜將多個細胞聚集成團, 即所謂的藍藻群體(Colonial cells, 或稱聚集體, aggregates), 可以有效抵抗原生動物和其他浮游動物的攝食[5,6], 也可提高對環境脅迫和噬藻體侵染的抗性。攝食壓力、細菌及某些環境理化因子則能夠促進微囊藻群體的形成和體積增大[7—9]。濾食性的鰱和鳙也因為藍藻群體外膠質層難以消化藻細胞。基于濾食性魚類和枝角類濾食作用的生物操縱手段對控制微囊藻水華的效果受到極大的限制[2], 水華藍藻資源的開發利用也非常困難。更為重要的是, 在微囊藻中, 群體細胞加之細胞中的偽空胞使得細胞成團漂浮、積聚在水面上, 即發生微囊藻水華。群體的形成、增大和形態的持續維持是微囊藻獲得種群優勢進而形成水華并維持優勢的前提之一[10]。如果能夠控制藍藻胞外多聚物的大量合成和藍藻群體的形成, 就有可能有效控制微囊藻水華的發生和發展。

藍藻胞外多糖的合成是藍藻群體形成的關鍵因素, 藍藻群體的形成和維持是藍藻水華發生的前提。藍藻多糖成分和結構分析以及生物合成途徑的了解還不夠深入, 至目前為止我們對細菌胞外多糖生物合成了解主要來源大腸桿菌等模式菌、少數工業微生物和假單胞菌等病菌的研究工作。莢膜胞外多糖(K-抗原)的生物合成與脂多糖(LPS)的O-抗原(由多個寡糖重復單位組成多糖鏈, 是細菌菌體抗原的抗原決定簇)的合成有相似之處。糖基轉移酶的催化下寡糖單位在細胞質中合成, 翻轉酶的作用翻轉穿過細胞質膜(內膜)進入周質空間, 在聚合酶作用下形成多糖鏈穿過細胞外膜分泌到胞外。對藍藻胞外多糖的單糖組成、糖鏈和結構所知甚少。水華微囊藻(Microcystis flos-aquae)C3-40株的黏液層多糖的單糖組成為乳糖(重量占比1.5%)、葡萄糖(2.0%)、木糖(3.0%)、甘露糖(5.0%)、鼠李糖(5.5%)和半乳糖醛酸(83%)[11]。聚合形成微囊藻胞外多糖的寡糖單位中包含鼠李糖、巖藻糖和木糖等單糖[12]。藍藻所合成和分泌的胞外多糖一部分溶于水中, 即所謂的溶解性多糖;另一部分結合在藻細胞表面, 即結合性多糖, 對于藍藻群體形成是必需成分[6,9, 13,14]。多糖中醛酸含量越高, 其黏附性越大[15]。通常認為二價鈣離子通過鹽橋作用促進胞外多糖形成黏性膠質, 進而包裹細胞形成群體[16,17]。組成胞外多聚物的其他生物大分子, 特別是胞外蛋白質, 在藍藻膠質層(Mucilage)和藍藻群體形成中也可能具有重要作用, 形成的機制更為復雜。

2 PEP-CTERM蛋白質的翻譯后加工和分選

除了胞外多糖, 藍藻群體胞外膠質層中還存在蛋白質和其他生物大分子。例如, 江和龍實驗室發現藍藻胞外多聚物中水溶性、與細胞松散相連的成分多為蛋白質, 胞外多糖則與藻細胞緊密相連[18]。20世紀90年代末發現在革蘭氏陽性菌(無細胞外膜)中, 蛋白分選酶(Sortase)可將擁有C端LPXTG基序的表面蛋白和菌毛通過共價鍵錨定到細胞壁的肽聚糖分子上[19]。經過對大量細菌基因組的生物信息學分析在革蘭氏陰性細菌(包括藍藻)中也鑒別出類似的分選酶同源基因, 這個分選酶基因(以前稱之為epsH)和推測的表面蛋白基因通常與胞外多糖合成基因簇相互關聯, 所鑒別的表面蛋白中通常具有C端的PEP基序, 而且富含可與糖基相連的絲氨酸和蘇氨酸(O-linked)和天冬酰胺(N-linked)殘基,因此將這種蛋白分選系統稱為PEP-CTERM/Exosortase(Exo意指胞外多糖)系統[20]。Exosortase (EpsH)為八次穿膜的膜蛋白, 可能與革蘭氏陽性的分選酶相似具有轉肽酶功能。PEP-CTERM基因的表達可能受到鄰近的RpoN(或稱Sigma 54)依賴的二組分系統PrsK/PrsR的調節。此外, 研究發現某些環境細菌中長鏈N-酰基氨基酸合成酶(酰基轉移酶)基因也多與PEP-CTERM/Exosortase分選系統基因連鎖, 因此長鏈N-酰基氨基酸有可能是組氨酸激酶PrsK的活化信號, 這類酰基轉移酶被稱為ExoAT[21]。

我們在活性污泥微生物喜樹脂動膠菌(Zoogloea resiniphila)MMB株中成功構建轉座子插入突變株庫, 篩選多個與菌膠團形成相關的突變株, 鑒定出一些與胞外多糖生物合成與組裝及菌膠團形成相關基因, 包括一個約40千堿基(KB)的大型基因簇, 并發現該基因簇中糖基轉移酶基因組成上存在種間和種內差異。還發現其中兩個編碼天冬酰胺合成酶的旁系同源基因在菌膠團形成過程中具有重要功能, 這2個基因突變或敲除后能夠阻斷或推遲菌膠團的形成[22]。我們還鑒定出另外一個由7個基因組成、參與菌膠團形成的基因簇, 其中3個基因(糖基轉移酶基因epsB2、脂蛋白基因prsT和參與合成甘露糖的尿苷二磷酸-N-乙酰-D-氨基葡萄糖胺脫氫酶基因ugd)插入失活或者敲除后基本檢測不到胞外多糖, 說明其參與多糖中的單糖成分合成或者胞外多糖的生物合成和分泌。敲除編碼二組分系統(Two-component system)的感受器組氨酸激酶(Sensor histidine kinase)基因prsK或者響應調節蛋白(Response regulator)基因prsR后, 胞外多糖的合成依然存在, 所合成的大量胞外多糖被分泌和溶解到培養基中, 不能包裹細菌細胞群形成菌膠團。我們進一步的研究表明一些PEP-CTERM蛋白質基因參與喜樹脂動膠菌的菌膠團形成, 其中2個基因pepA和pepE轉錄水平高, 并且受到RpoN、PrsK和PrsR的調節[23]。在prsK或者prsR基因敲除突變株中過量表達pepA基因可以恢復菌膠團形成表型, 胞外多糖也不再溶解到培養基中而是包裹到細胞團上。PepA蛋白質的氨基(氮)端具有典型的分泌信號肽, 首先通過II型分泌系統到周質空間, 其羧基(碳)端肽段也被切割下來形成成熟肽, 切割位點位于PEP基序下游, 其進一步分選和修飾則有待進一步研究[23,24]。

此前, 我們在另一株菌膠團(絮團)形成菌解叔丁醇水居菌(Aquincolatertiaricarbonis)RN12株中,大量篩選絮狀物形成缺失的突變株, 鑒定到一個類似的胞外多糖合成基因簇以及一些其他基因,rpoN1 sigma因子(σ54)基因, 利用遺傳互補分析確定RpoN1是菌膠團形成的主要調控基因之一。有趣的是, 該基因插入突變株中所合成的大量胞外多糖也被分泌和溶解到培養基中, 不能包裹細菌細胞群形成菌膠團。分析發現RpoN1并不影響胞外多糖合成基因的轉錄, 說明RpoN1所調控的基因在表達后也可能通過調節PEP-CTERM蛋白質的表達和分選機制使胞外多糖鏈緊密地結合在細菌群體的表面以形成菌膠團, 而不是直接調控胞外多糖的合成。RN12菌株有rpoN1、rpoN2、rpoN3和rpoN4等4個旁系同源基因, 但只有RpoN1能調控菌膠團的形成, 并且RpoN1調節該菌株的群集運動(Swarming motility)和生物被膜形成(Biofilm formation)[25]。由于擁有4個rpoN基因,rpoN1的敲除并沒有造成象動膠菌rpoN敲除突變株那樣生長緩慢, 也幾乎檢測不到胞外多糖[23]。無獨有偶, 該菌基因組擁有數十個編碼PEP-CTERM蛋白質的基因。這些結果說明動膠菌和水居菌等Beta變形菌形成菌膠團(或稱絮狀物)的機理非常相似。我們進一步揭示這些基因和基因簇在其他的菌膠團形成菌包括解殼聚糖松江菌(Mitsuaria chitosanitabida)和Pseudoduganella eburnean中也發揮同樣的功能[26,27]。胞外多糖和PEP-CTERM結構域蛋白質共同介導的菌膠團/絮團形成是多種微生物所共同擁有的一個普遍現象,藍藻極可能也是如此。

除原綠球藻(Prochlorococcus)外, 微囊藻等大多數藍藻中均存在類似的PEP/Exosortase分選酶系統[28]。藍藻中的分選酶分為2個亞族, 命名為藍藻外分選酶A(Cyanoexosortase A, 簡稱CrtA)和B(cyanoexosortase B, 簡稱CrtB)[28]。微囊藻中擁有CrtB,在我所已完成基因組測序的太湖和滇池微囊藻藻株中也發現crtB基因[29]。我們從產微囊藻毒素的銅綠微囊藻(Microcytis aeruginosa)NIES-843株基因組中可初步鑒定出33個編碼PEP-CTERM結構域蛋白質的基因[30]。而不產毒的Microcytissp. MC19株基因組中也編碼45個PEP-CTERM結構域蛋白質[31]。從太湖梅梁灣分離的片狀微囊藻(Microcystis panniformis)FACHB1757株基因組中也編碼32個PEPCTERM蛋白質[32]。魚腥藻(Anabaena variabilisATCC 29413)和念珠藻(Nostocsp. PCC 7120)中分別擁有36和42個PEP-CTERM蛋白質編碼基因。Daniel H. Haft還從一些藍藻(包括Cyanothece,Nostoc,Trichodesmium,Lyngbya,Arthospira)中鑒定出一個亞類, 稱之為cyano_PEP(TIGR04155), 在CTERM的跨膜區有典型的GXXXXGXG(X指任意氨基酸殘基)基序。這些PEP-CTERM家族基因所編碼的蛋白質可能分泌和錨定到細胞表面, 其功能完全未知。這些PEP-CTERM基因大概占許多藍藻基因組基因總數的1/20強, 絕非偶然現象。我們有理由推測這些PEP-CTERM蛋白質可能通過特殊的分選系統分泌到細胞表面, 與胞外多糖通過糖基化作用形成結構更復雜的胞外多聚物, 介導細胞群體的形成和水華發生。

3 群體感應、微囊藻毒素與藍藻群體形成

藍藻群體和微生物菌膠團(絮團)是一種微生物細胞的群體行為, 可以被認為是一種特殊的生物被膜, 只不過不需要附著在物理和生物表面而已。群體感應(Quorum sensing, 縮寫為QS)是微生物細胞間信息交流的一種方式, 可根據種群密度閾值(Quorum)來調節基因的表達。細菌可感知自身合成的自誘導分子(Autoinducer, 簡稱AI)的濃度(反映細胞密度)變化, 當信號分子濃度達到臨界閾值后,QS系統可調控特定基因表達過程。革蘭氏陰性菌主要利用不同的長鏈N-酰基高絲氨酸內酯(N-acylhomoserine lactones, 簡稱AHLs)作為群體感應系統的AI分子(AI-1)。QS可調控多種生理過程如生物發光、質粒接合轉移、感受態與孢子形成、抗生素合成、胞外酶和毒素產生、生物被膜形成和細胞分化等。人工干擾細菌QS有助于控制病菌的感染, 同理可能控制微囊藻水華的形成和微囊藻毒素的產生。藍藻中群體感應現象研究較少。在附著生長的黏桿藻(Gloeothece)無菌株PCC6909中存在C8 N-酰基高絲氨酸內酯[33], C8-AHL的積累可以調節糖代謝、氨基酸代謝和生物被膜形成。在固氮絲狀藻魚腥藻PCC 7120中存在一個具有AHL分解功能的酯酶基因(aiiC), 該酶可以分解一系列的AHL分子, 可能淬滅QS信號(Quorum quenching, 群體感應淬滅)[34]。多種AHL分子可以抑制魚腥藻的固氮反應[35]。微囊藻中是否存在QS尚無定論, 南京大學學者在微囊藻無菌株PCC-7820代謝產物中檢測到AHL信號分子[36]。群體感應是否參與藍藻群體形成也無定論。

我所研究人員發現產毒微囊藻細胞在生長過程中釋放到胞外的微囊藻毒素(MCs)可能具有信號物質的功能, 可激活產毒及非產毒微囊藻細胞中某些與多糖合成相關基因的表達和誘導胞外多糖產物的釋放, 進而促進微囊藻群體的聚集。如果及時、持續地清除釋放到胞外的微囊藻毒素分子, 微囊藻群體的尺寸則會顯著減小。微囊藻毒素在微囊藻群體形態的維持中可能具有重要作用[10]。有趣的是, 藍藻中并無sigma54家族的RpoN sigma因子(表 1)。微囊藻中作為信號分子的微囊藻毒素所結合的受體分子應該與其他擁有RpoN的革蘭氏陰性細菌有所不同, 需要進一步研究加以揭示。

表1 水華藍藻銅綠微囊藻和菌膠團形成菌喜樹脂動膠菌胞外多聚生物合成與藍藻群體/細菌菌膠團形成相關基因比較Tab. 1 Comparison of between bloom-forming cyanobacterium Microcystis aeruginosa NIES-842 and floc-forming proteobacterium Zoogloea resiniphila MMB strain

4 展望

微囊藻的分子遺傳操作非常困難, 迄今為止只有一項報道在微囊藻成功進行基因失活的研究[37]。這極大地限制了微囊藻遺傳分析和基因功能的鑒定, 某些遺傳分析不得不在集胞藻(Synechocystis)中進行[38]。盡管如此, 面對國家需求, 為闡明微囊藻水華發生機制, 我國學者已作出極大的努力, 在微囊藻基因組學、微囊藻越冬機制和微囊藻群體形成和維持機理方面取得了顯著進展。希望在不久的將來, 建立微囊藻遺傳操作方法和系統, 特別是CRISPR-Cas9基因技術在藍藻中的應用, 深入開展微囊藻胞外多聚物生物合成、表面蛋白分選、群體感應和水華發生機制相關分子遺傳和功能基因組學研究, 揭示藍藻群體形成的分子機制, 探索控制微囊藻水華發生的新型途徑。