丙戊酸通過Mitf通路促進企鵝珍珠貝黑色素合成

于非非 吳金賢 鐘智明 梁綺雯 劉 永

(廣東海洋大學水產學院, 湛江 524088)

企鵝珍珠貝[Pteria penguin(R?ding;1798)]具有培育大型優質海水珍珠的多種優勢, 被看作我國“振興南珠”最有潛力的品種。珍珠的色澤是評判珍珠品質的重要指標, 目前企鵝珍珠貝所產珍珠多以墨綠色、藍黑色等深色系列為主, 這主要取決于黑色素的絕對優勢[1]。篩選珍珠貝有效的黑色素增強劑, 調控增加黑色素的含量, 有望生產出純黑的大顆粒珍珠, 大幅度提高珍珠品質。

丙戊酸(Valproic acid, VPA)因具有抑制組蛋白脫乙酰基酶的活性, 作為一種廣譜的抗癇藥物[2]和潛在的抗癌藥物[3,4]而被開發和應用。近些年, 越來越多研究發現丙戊酸具有促進人類黑色素細胞生成的作用[5,6]。我們前期研究發現, 低濃度丙戊酸可以加深企鵝珍珠貝1—7月齡稚貝殼色, 而不降低其存活率[7], 暗示著丙戊酸可以影響企鵝珍珠貝黑色素合成, 這對于珍珠貝色澤調控提供了新的啟示。

哺乳動物黑色素的合成是一個復雜的過程, 至少有3條通路參與了這個過程[8,9]。貝類黑色素相關研究較少, 尚無完整信號通路報道。我們前期研究發現, 環磷腺苷效應元件結合蛋白(cAMP response element binding protein,Creb2)、小眼相關轉錄因子(Melanogenesis associated transcription factor,Mitf)、酪氨酸酶(Tyrosinase,Tyr)、Cdk2 (Cyclindependent kinase 2) 和Bcl2 (B-cell lymphoma2) 等基因可能參與了企鵝珍珠貝的黑色素合成, 一個Creb2-Mitf-Tyr-melanin軸可能存在于企鵝珍珠貝黑色素合成信號通路中[10,11]。那么, 丙戊酸是否可調控企鵝珍珠貝成貝黑色素的合成, 又是通過怎樣的途徑發揮作用, 成為值得探討的問題。

基于以上目的, 本研究首先通過存活率檢測,分析生產上安全有效的丙戊酸作用濃度和時間; 利用HPLC-MS/MS檢測和酪氨酸酶活性分析, 驗證丙戊酸對企鵝珍珠貝黑色素合成的影響; 通過realtime RT-PCR, 分析丙戊酸對Mitf和Tyr等一系列黑色素相關基因表達的影響, 以闡明丙戊酸調控企鵝珍珠貝黑色素合成的作用途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗所用的企鵝珍珠貝取自廣西北海潿洲島,重400—450 g, 殼長13—15 cm。實驗貝在25—26℃的循環海水中暫養1周, 期間主要投喂扁藻(Isochrysis zhanjiangensis)和湛江等鞭金藻(Platymonas subcordiformis)。

1.2 丙戊酸處理及存活率分析

將企鵝珍珠貝分成4組, 每組30個樣品。實驗組分別用終濃度為1、10和100 mmol/L的丙戊酸浸泡處理24h、48h和72h, 接著置于新鮮海水中休養;對照組為不含丙戊酸的海水養殖組。第7天時, 計算每組實驗貝的存活率, 取其外套膜用于基因表達分析、酪氨酸酶活性分析和黑色素檢測。

1.3 總RNA提取和cDNA合成

使用RNeasy Mini Kit(Qiagen,Gaithersburg MD)提取企鵝珍珠貝的外套膜總RNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量, 用NanoDrop ND1000分光光度計測定RNA含量。利用Superscript Ⅱpolymerase kit(全式金, 北京, 中國)反轉錄合成cDNA。

1.4 熒光定量PCR分析

利用SYBF Green qPCR Kit(Thermo scientific,Waltham, MA, USA)和 7500/7500 Fast Real-time系統(ABI, Carlsbad, CA, USA)進行qRT-PCR檢測。以企鵝珍珠貝18S rRNA作為內參, 每個樣品做3個重復, 每組做6個平行樣品。采用2-??Ct法計算相關基因的相對表達水平, 所用引物見表 1。

表1 所用引物序列Tab. 1 Primers used in the study

1.5 酪氨酸酶活性分析

取0.5 g企鵝珍珠貝外套膜組織加入1 mL 0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS, pH 6.8), 徹底勻漿; 10000 r/min離心10min, 以獲得上清液; 將0.5 mL組織上清液、0.5 mL 5 mmol/L L-DOPA和2.4 mL 0.1 mmol/L PBS混合均勻, 于37℃水中孵育30min, 在分光光度計475 nm處檢測吸光值。酪氨酸酶活性用475 nm處孵育30min增加或減少的吸光值來代表, 每組分析6個平行樣品。

1.6 黑色素的提取與氧化

取0.5 g外套膜組織, 勻漿徹底后加入15 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.4)和0.3 g(2%m/v)木瓜蛋白酶,55℃下酶解20h, 離心收集沉淀。依次用2 mL石油醚、無水乙醇和去離子水洗滌, 完全干燥即得黑色素粗品。然后將黑色素粗品溶解于8.6 mL 1 mol/L K2CO3和0.8 mL 3% H2O2混合液中, 100℃水浴20min; 取出冷卻至常溫后加入0.4 mL 10% Na2SO3終止反應, 用6 mol/L HCl調節pH至1.0。離心后取上清, 用70 mL乙醚萃取2次, 干燥獲得結晶。用0.5 mL 10%甲醇溶液復溶, 0.45 μm有機濾膜中過濾, 即得黑色素堿性氧化產物。每組提取氧化并分析6個平行樣品。

1.7 LC-MS/MS分析

利用LC-MS/MS檢測黑色素堿性氧化產物的含量和成分[12,13]。利用高效液相色譜系統(Waters,Milford, Massachusetts, USA)對色譜分離, 其色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSST3 (2.1 × 50 mmol/L,1.7 μm)。流動相A為0.1% (v/v)甲酸水溶液, 流動相B為0.1% (v/v)甲酸甲醇溶液。分析開始時流動相A和B的比例分別為90%A和10%B; 3min后, 使用線性梯度將流動相B的分數增加至100%; 5min后, 使用線性梯度將流動相比率恢復至初始條件, 每個循環7min, 在40℃下以0.3 mL/min的流速進行分析。使用Xevo TQ 三重四極桿質譜的ESI模式進行MS分析。源溫度為150℃, 去溶劑化溫度為550℃, 錐形氣體流量為50 L/h, 去溶劑化氣體流量為1100 L/h,碰撞氣體流量為0.14 mL/min(氬氣)。使用MRM模式檢測, 參數如表 2。

1.8 統計學分析

采用SPSS19.0(IBM, Armonk, State of New York, USA)進行方差分析, 檢測不同樣本間差異的顯著性。顯著性差異以*表示(P<0.05), 極顯著差異以**表示(P<0.01)。

2 結果

2.1 丙戊酸的生物毒性檢測

為了檢測丙戊酸對企鵝珍珠貝的生物毒性, 同時摸索生產上可安全使用的作用濃度和作用時間,我們檢測了1、10、100 mmol/L VPA作用0、24h、48h和72h對企鵝珍珠貝存活率的影響。如圖 1所示, 1和10 mmol/L VPA作用0—72h, 對企鵝珍珠貝的存活率均無顯著影響(P>0.05)。但100 mmol/L VPA作用24h、48h和72h顯著降低存活率至83.3%(P<0.05), 76.7%(P<0.05)和70.0%(P<0.01), 并顯示出明顯的時間依賴效應。這說明高濃度(100 mmol/L)丙戊酸作用24h以上對企鵝珍珠貝成貝具有一定的生物毒性, 10 mmol/L作用72h是最大的安全使用濃度和作用時間。

2.2 丙戊酸增加企鵝珍珠貝黑色素的含量

為了驗證丙戊酸是否可影響企鵝珍珠貝的黑色素合成, 利用LC-MS/MS分析1、10和100 mmol/L丙戊酸處理72h后, 企鵝珍珠貝外套膜中黑色素含量的變化。因黑色素的主要成分是不溶于酸堿溶液的DHI(5,6-di hydroxyindole)和DHICA(5,6-di hydroxyindole-2-carboxylic acid), 但其堿性氧化產物PDCA(Pyrrole-2, 3-dicarboxylic acid)和PTCA(Pyrrole-2,3,5-tricarboxylic acid)可溶于酸溶液和堿溶液, 因此PDCA和PTCA被廣泛用于黑色素的定性和定量分析。由圖 2所示, 1 mmol/L VPA對企鵝珍珠貝的黑色素含量沒有顯著影響(P>0.05)。10 mmol/L VPA可顯著提高黑色素的含量(PDCA+PTCA)43.7%(P<0.05), 100 mmol/L VPA可顯著提高黑色素的含量(PDCA+PTCA)47.1%(P<0.05)。以上數據說明,高濃度的丙戊酸(≥10 mmol/L)作用72h可有效促進企鵝珍珠貝的黑色素合成。

表2 質譜檢測參數Tab. 2 Details of mass spectrometric detection

圖1 丙戊酸的毒性檢測Fig. 1 The toxicity test of valproic acid on P. penguin

圖2 丙戊酸對黑色素含量的影響Fig. 2 The effects of VPA on melanin content of P. penguin

2.3 丙戊酸提高企鵝珍珠貝酪氨酸酶活性

酪氨酸酶是黑色素合成的限速酶, 酪氨酸酶活性升高是黑色素合成的重要標志[12]。比較丙戊酸處理前后外套膜的酪氨酸酶活性, 以進一步確定丙戊酸對企鵝珍珠貝黑色素合成的影響。以475 nm波長下L-DOPA轉化為多巴色素(Dopachrome)的速率代表酪氨酸酶活性。1 mmol/L VPA作用72h, 對酪氨酸酶活性沒有顯著影響(P>0.05); 10 mol/L VPA可使酪氨酸酶活性增加59.7%(P<0.05), 100 mol/L VPA則可使酪氨酸酶活性顯著增加136.1%(P<0.01,圖 3)。這說明高濃度的丙戊酸(≥10 mol/L)可以顯著增加企鵝珍珠貝酪氨酸酶活性。

2.4 丙戊酸調控黑色素合成通路基因的表達

為了闡述丙戊酸發揮作用的信號通路, 我們對丙戊酸處理72h后黑色素合成相關基因的表達進行分析。如圖 4所示, 1 mol/L VPA對Creb2、Mitf、Tyr、Bcl2和Cdk2等基因的表達均無顯著影響(P>0.05)。10 mol/L VPA可以顯著提高Mitf的表達至1.65倍(P<0.05), 100 mol/L 可提高至1.93倍(P<0.05)。相應地, 10 mol/L VPA可使Tyr轉錄本提高至1.38倍(P<0.05), 100 mol/L 可使Tyr轉錄本提高至2.10倍(P<0.01)。10 mol/L VPA增加Bcl2轉錄本至1.90倍(P<0.01), 100 mol/L VPA增加Bcl2轉錄本至2.73倍(P<0.01)。但是, VPA對Creb2的表達沒有顯著影響(P>0.05), 即使VPA的濃度高達100 mol/L。另外,10 mol/L VPA可顯著提高Cdk2表達水平至1.47倍(P<0.05), 但100 mol/L VPA對Cdk2卻未產生明顯的影響(P>0.05)。

圖3 丙戊酸對酪氨酸酶活性的影響Fig. 3 The effect of VPA on tyrosinase activity of P. penguin

圖4 丙戊酸對黑色素合成通路基因表達的影響Fig. 4 The effect of VPA on expression of PpCreb, PpMitf,PpTyr, PpBcl2 and PpCdk2

3 討論

3.1 丙戊酸可有效促進企鵝珍珠貝黑色素合成

黑色素參與了有機體多種生物學過程, 包括著色、皮膚保護、癌癥和老化等[13], 黑色素增強劑和抑制劑的開發在臨床上具有重要的價值[14,15], 對于水產動物則具有重要經濟價值[16]。丙戊酸是一種短鏈脂肪酸, 具有抗驚厥和抗癌等多種作用[17], 也被報道可以促進人類黑色素細胞的生長和黑色素的合成[4,6], 但是否在貝類具有相似的作用未見報道。本研究利用不同濃度的丙戊酸處理企鵝珍珠貝成貝, 發現≥10 mol/L丙戊酸處理72h可以顯著增加黑色素含量, 暗示丙戊酸能夠影響企鵝珍珠貝黑色素合成。同時, 丙戊酸還可顯著提高酪氨酸酶活性, 因為酪氨酸酶是黑色素合成的關鍵限速酶, 酪氨酸酶活性被作為黑色素合成的重要標志[12], 因此,酪氨酸酶活性的升高進一步證實丙戊酸可以有效地促進企鵝珍珠貝的黑色素合成。

3.2 丙戊酸通過Mitf通路影響企鵝珍珠貝黑色素合成

在哺乳動物的黑色素合成通路中,Mitf是核心轉錄因子[18], 可與Tyr啟動子的M-box(CATGTG)或E-box(CACGTG)結合, 激活黑色素合成限速酶Tyr的表達, 參與黑色素的合成[19,20]。Mitf還可以通過轉錄激活Bcl2基因, 參與調控黑色素細胞的存活[21,22]; 通過轉錄激活Cdk2基因, 參與調控黑色素細胞的增殖[8]。在本研究中, 丙戊酸顯著增加了Mitf的表達水平, 同時顯著提高了Tyr、Bcl2和Cdk2等基因的表達水平, 暗示丙戊酸可能通過Mitf基因影響了細胞的黑色素合成、細胞存活和增殖過程,也進一步證實企鵝珍珠貝中Mitf作為核心轉錄因子的可能性。需要說明的是, 100 mol/L VPA可使Mitf轉錄本顯著提高, 但并未顯著提高Cdk2的表達。一個可能的原因是高濃度VPA對細胞具有一定毒副作用, 這種毒副作用不利于細胞的生長。雖然VPA誘導表達了大量MITF蛋白, 但MITF更多參與了黑色素的合成和細胞的存活過程, 以幫助細胞提高存活率。

Creb2是一種細胞核內轉錄因子, 具有典型的亮氨酸拉鏈結構域。在CREB磷酸化后, 可以識別Mitf啟動子的CRE(cAMP response element)序列, 調控Mitf的表達[23,24]。值得一提的是, 本研究中VPA可以顯著提高Mitf以及其下游基因的表達, 但不能影響Creb2的表達。一種可能的解釋是, VPA可能影響了CREB的磷酸化過程, 但對Creb2的轉錄沒有影響, VPA仍是通過Creb-Mitf-Tyr-melanin發揮作用。Lin等[25]利用小鼠P12細胞進行體外實驗發現,VPA可以增加磷酸化CREB的水平, 提高CREB活性, 激活CREB依賴的cAMP信號通路, 這為我們的推論提供了佐證。VPA不影響Creb2的另一可能原因是, VPA并不依賴于Creb2發揮作用,而是通過其他轉錄因子調控Mitf-Tyr-melanin通路, 最終調控企鵝珍珠貝黑色素的合成。

3.3 丙戊酸安全作用濃度和作用時間分析

丙戊酸是否存在毒副作用是一個有爭議的問題。Lin等[25]認為丙戊酸可以在臨床上廣泛用于治療神經類疾病, 沒有任何副作用。Chodurek等[5]卻報道, 1 mol/L丙戊酸作用3d即可顯著提高人類A-375細胞的黑色素的含量, 降低細胞的存活率。本研究發現, 1 mol/L丙戊酸對企鵝珍珠貝黑色素的含量、酪氨酸酶活性、相關基因表達水平以及存活率均無顯著影響; 10 mol/L丙戊酸處理72h可顯著提高黑色素的含量、酪氨酸酶活性和相關基因表達水平, 但對成貝存活率仍無顯著影響; 但100 mol/L丙戊酸處理72h在提高黑色素的含量、酪氨酸酶活性和相關基因表達的同時, 也顯著降低了成貝存活率。因此, 雖然貝類活體比人類細胞顯示出更強的耐受性, 但高濃度(100 mol/L)的丙戊酸對貝類是具有一定毒性的, 10 mol/L丙戊酸處理72 h對于企鵝珍珠貝可能是最大作用濃度和最長作用時間, 這為在生產上建立珍珠貝的色澤優化技術提供了重要數據。