姜黃素對MRL/lpr狼瘡性腎炎小鼠的作用及機制研究*

劉 謂， 戴 暉， 安樂美， 閻 磊， 邵鳳民△

（1河南省人民醫(yī)院/鄭州大學(xué)人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，河南鄭州450003；2新疆哈密紅星醫(yī)院腎內(nèi)科，新疆哈密839000；3河南省人民醫(yī)院/鄭州大學(xué)人民醫(yī)院腎內(nèi)科，河南鄭州450003）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種以淋巴細胞異常活化產(chǎn)生大量自身抗體并累及多系統(tǒng)、多器官的慢性自身免疫性疾病［1］。狼瘡性腎炎（lupus nephritis，LN）是SLE最常見且最嚴重的并發(fā)癥之一，也是造成SLE患者死亡的主要原因［2-3］。目前臨床上常采用激素和免疫抑制劑治療LN，改善患者預(yù)后，但仍有部分患者最終進展為終末期腎病［4］。目前研究認為，免疫調(diào)節(jié)失衡和、炎癥等是LN的重要發(fā)病機制［5］，因此尋找新的、有效的治療方法調(diào)節(jié)免疫功能并控制炎癥反應(yīng)，對治療LN、改善病情及預(yù)后具有重要意義。姜黃素（curcumin，Cur）是一種多酚類中藥單體，具有抗炎、抗氧化、抗增殖、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用，已被廣泛用于治療各種疾病［6-8］。本研究擬觀察Cur對MRL/lpr小鼠的影響及其可能機制，為臨床治療LN提供新的思路。

材料與方法

1 試劑

姜黃素純度為99%，購自Sigma；血清肌酐（serum creatinine，SCr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）和抗雙鏈DNA（double-stranded DNA，dsDNA）檢測試劑盒及炎癥因子ELISA試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司；抗p-IκB、NF-κB、NLRP3、caspase-1、核仁纖維蛋白（fibrillarin）和GAPDH抗體購于Abcam。

2 方法

2.1 動物分組與處理 10只C57BL/6小鼠及30只MRL/lpr小鼠，雌性，體重（20±2）g，10周齡，購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司。所有動物實驗均經(jīng)本院倫理委員會批準。將MRL/lpr小鼠隨機分為MRL/lpr組（灌胃等體積生理鹽水）及Cur低、高劑量組（Cur-L和Cur-H組，分別給予100和200 mg/kg Cur灌胃處理），每組10只；C57BL/6小鼠為正常對照（normal control，NC）組（灌胃等體積生理鹽水）。灌胃均每天1次，連續(xù)12周。

2.2 尿蛋白檢測 分別于處理前及處理后每2周留取各組小鼠的尿液進行尿蛋白檢測。將尿液稀釋10倍后，使用BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測尿液中的蛋白含量，嚴格按照說明書進行操作。酶標儀（波長562 nm）測定吸光度。根據(jù)標準品計算樣品的蛋白濃度。

2.3 SCr及BUN水平的測定 最后一次給藥2 h后，麻醉狀態(tài)下斷頸處死小鼠，而后眼球取血，離心后取血清，-80℃凍存。采用全三硝基苯酚比色法和脲酶法分別測定SCr和BUN水平，操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。

2.4 腎臟組織的病理形態(tài)學(xué)觀察 小鼠取血完成后迅速于冰臺上解剖取腎組織，部分腎組織于4%的甲醛溶液固定，乙醇洗脫后進行石蠟包埋，制備成2μm左右的切片進行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟組織的形態(tài)學(xué)變化。按照Austin等［9］的方法，隨機選取50個腎小球，對其進行腎小球增生和中性粒細胞浸潤分析。

2.5 ELISA檢測炎癥因子及抗dsDNA水平 取部分新鮮腎組織，制成勻漿，4℃離心15 min，取上清液進行炎癥因子檢測。ELISA試劑盒檢測血清和腎臟組織中IL-1β、IL-6和TNF-α水平及血清中抗dsDNA的含量，嚴格按照試劑盒操作進行。

2.6 Western blot實驗 取部分腎組織，采用蛋白提取試劑盒提取總蛋白，然后再分別采用細胞核蛋白和細胞漿蛋白抽提試劑盒提取腎組織核蛋白和胞漿蛋白，嚴格按照試劑盒說明書操作。其中總蛋白用于檢測NLRP3和caspase-1蛋白水平，胞漿蛋白用于檢測p-IκB蛋白水平，胞核蛋白用于檢測胞核NF-κB蛋白表達。BCA法測定蛋白濃度后，取40μg蛋白樣品進行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)到PVDF膜，采用脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加I抗［抗p-IκB、NLRP3、caspase-1、NF-κB、GAPDH（胞漿蛋白內(nèi)參照）和fibrillarin（胞核蛋白內(nèi)參照）抗體，均1∶1 000稀釋］4℃孵育過夜。然后加入HRP標記的II抗IgG（1∶2 000），室溫孵育1 h。化學(xué)發(fā)光顯影后采用ImageJ計算目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值，即目的蛋白的相對表達量。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 姜黃素對MRL/lpr小鼠尿蛋白含量的影響

各組小鼠各時點尿蛋白含量比較結(jié)果顯示，MRL/lpr組小鼠尿蛋白含量顯著高于NC組，且隨時間延長而升高（P＜0.05）；與MRL/lpr組比較，Cur組在處理后10和12周時的尿蛋白含量顯著降低，且Cur-H組在12周時顯著低于Cur-L組（P＜0.05），見圖1。

Figure 1. Comparison of urine protein content in each group at different time points.Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs NC group；#P＜0.05 vs MRL/lpr group；&P＜0.05 vs Cur-L group.圖1 各組小鼠不同時點尿蛋白含量的比較

2 姜黃素對MRL/lpr小鼠腎組織病理學(xué)變化的影響

各組小鼠腎組織HE染色結(jié)果顯示，NC組腎臟結(jié)構(gòu)清晰完整，未見增生和炎癥細胞浸潤；MRL/lpr組出現(xiàn)明顯的腎小球系膜細胞增生，伴有炎癥細胞浸潤；與MRL/lpr組相比，Cur組系膜細胞增生、炎癥細胞浸潤得到不同程度的緩解，見圖2A。同時，與NC組比較，MRL/lpr組腎小球增生比例和中性粒細胞浸潤比例顯著升高（P＜0.05）；Cur組腎小球增生比例和中性粒細胞浸潤比例顯著降低，且Cur-H組顯著低于Cur-L組（P＜0.05），見圖2B、C。

Figure 2.The effect of Cur on pathological changes of renal tissues in MRL/lpr mice.A：HE staining of the renal tissues（scale bar=50μm）；B：the percentages of glomerular proliferation；C：the percentages of neutrophil infiltration.Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs NC group；#P＜0.05 vs MRL/lpr group；&P＜0.05 vs Cur-L group.圖2 姜黃素對MRL/lpr小鼠腎組織病理學(xué)變化的影響

3 姜黃素對MRL/lpr小鼠腎功能指標及抗dsDNA的影響

與NC組相比，MRL/lpr組SCr、BUN及血清抗dsDNA水平顯著增加（P＜0.05）；與MRL/lpr組相比，Cur組SCr、BUN及血清抗dsDNA水平顯著降低，且Cur-H組顯著低于Cur-L組（P＜0.05），見表1。

表1 各組小鼠SCr、BUN及血清抗dsDNA水平的比較Table 1.Comparison of SCr，BUN and serum anti-dsDNA level in each group（Mean±SD.n=10）

4 姜黃素對MRL/lpr小鼠炎癥因子水平的影響

與NC組比較，MRL/lpr組血清和腎組織中IL-1β、IL-6及 TNF-α 水平均顯著升高（P＜0.05）；與MRL/lpr組比較，Cur組血清和腎組織中IL-1β、IL-6及TNF-α水平顯著降低，且Cur-H組顯著低于Cur-L組（P＜0.05），見表2。

表2 各組小鼠血清及腎組織中IL-1β、IL-6及TNF-α水平的比較Table 2.Comparison of serum and kidney levels of IL-1β，IL-6 and TNF-α in the mice of each group（ng/L.Mean±SD.n=10）

5 姜黃素對NF-κB信號通路的影響

Western blot結(jié)果顯示，與NC組比較，MRL/lpr組小鼠腎組織中p-IκB和NF-κB蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；與MRL/lpr組比較，Cur組小鼠腎組織中p-IκB和NF-κB蛋白水平顯著降低，且Cur-H組顯著低于Cur-L組（P＜0.05），見圖3。

Figure 3.The effect of Cur on expression of NF-κB signaling pathway-related proteins.Mean±SD.n=10.*P＜0.05vs NC group；#P＜0.05 vs MRL/lpr group；&P＜0.05 vs Cur-L group.圖3 Cur對NF-κB信號通路相關(guān)蛋白的影響

6 姜黃素對NLRP3炎癥信號通路表達的影響

與NC組相比，MRL/lpr組小鼠腎組織中NLRP3和caspase-1的蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；與MRL/lpr組比較，Cur組小鼠腎組織中NLRP3和caspase-1的蛋白水平顯著降低，且Cur-H組顯著低于Cur-L組（P＜0.05），見圖4。

討 論

Figure 4.The effect of Cur on the protein expression of NLRP3 and caspase-1.Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs NC group；#P＜0.05 vs MRL/lpr group；&P＜0.05 vs Cur-L group.圖4 Cur對NLRP3和caspase-1蛋白表達的影響

LN是造成SLE患者死亡的主要原因之一，其治療效果與SLE患者的遠期預(yù)后及生存率密切相關(guān)［3，10］。目前臨床上常用激素和免疫抑制劑治療LN，以提高患者的生存率，但仍有部分患者的效果不佳或無效［4］，臨床仍迫切需要尋找新的治療LN的有效藥物。Cur是一種植物多酚，具有抗炎、抗氧化及抗纖維化等廣泛的生物學(xué)活性，且被證實對腎損傷具有一定的保護作用［11-13］。Fan等［14］研究發(fā)現(xiàn)Cur可通過抑制Akt磷酸化，上調(diào)APPL1表達，進而保護缺血再灌注引起的急性腎損傷。本研究以MRL/lpr小鼠作為LN動物模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cur灌胃處理后MRL/lpr小鼠的尿蛋白、腎功能指標SCr和BUN水平均顯著降低，且血清中SLE標志物抗dsDNA抗體顯著減少，說明Cur能改善MRL/lpr小鼠的腎損傷。

NF-κB是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥反應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)及機體免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用［15］。多項研究表明NF-κB信號通路在感染、損傷或自身免疫等因素引起的腎炎中發(fā)揮重要作用［16］。研究顯示MRL/lpr小鼠腎組織中NF-κB被激活，并伴隨大量炎癥因子的產(chǎn)生，而抑制NF-κB的激活能夠改善MRL/lpr小鼠的腎損傷［17-18］。因此，NF-κB信號通路可作為治療LN的潛在靶點。肇寅輝等［19］研究發(fā)現(xiàn)Cur可通過抑制NF-κB的表達，降低細胞炎癥反應(yīng)，減輕大鼠干熱環(huán)境下的腎損傷。本研究結(jié)果顯示，Cur處理后MRL/lpr小鼠腎組織中p-IκB和NF-κB的蛋白表達水平及血清和腎組織中的IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著降低，同樣表明Cur可通過抑制NF-κB的活化，減少其下游炎癥因子的釋放，從而發(fā)揮對LN的保護作用。此外，研究表明由NLRP3、ASC和caspase-1組成NLRP3炎癥小體復(fù)合物也參與了LN的發(fā)生、發(fā)展［20］。多項研究表明NLRP3炎癥小體復(fù)合物在MRL/lpr小鼠腎組織中表達上調(diào)，阻斷NLRP3炎癥小體，能降低蛋白尿水平、抑制自身抗體的產(chǎn)生、減少促炎癥細胞因子IL-1β和IL-18的釋放，減弱MRL/lpr小鼠LN發(fā)病的嚴重程度［21-22］。因此，抑制NLRP3炎癥體的活化可能是治療LN的新靶點。Lu等［23］研究發(fā)現(xiàn)Cur可以通過抑制NLRP3炎癥小體活性來改善糖尿病腎病。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cur處理能顯著抑制MRL/lpr鼠腎組織中NLRP3和caspase-1的蛋白表達量，說明Cur處理能顯著抑制抑制腎組織中NLRP3炎癥小體的活化，抑制炎癥反應(yīng)，從而在LN中發(fā)揮保護作用。此外，還有研究表明抑制NF-κB的活化能抑制NLRP3的表達［24］，但在MRL/lpr小鼠腎組織中NLRP3活化是否由NF-κB信號通路調(diào)控還需要進行更深入的研究。

綜上所述，Cur對MRL/lpr小鼠具有顯著的腎保護作用，其作用機制可能是與抑制NF-κB信號通路和NLRP3炎癥小體的活化有關(guān)。本研究為LN的治療提供了新的思路，初步揭示了Cur的作用機制，也為Cur的臨床應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。