組蛋白伴侶ASF1B在前列腺癌細胞的表達及其對體外細胞活力的影響*

蔡江怡， 朱樂樂

（1溫州市中西醫結合醫院泌尿外科，2溫州市中醫院病理科，浙江溫州25000）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是男性中常見的惡性腫瘤之一［1］。目前，PCa的治療效果并不令人滿意，PCa遠處轉移患者的5年生存率僅為20%［2］。因此，有必要開發一種安全有效的PCa治療靶點［3］。抗沉默功能蛋白1（anti-silencing function 1，ASF1）最初在酵母中被鑒定，屬于組蛋白H3-H4伴侶蛋白［4］。ASF1具有調節染色質功能，并已被證明有助于腫瘤發生。ASF1有2個主要的亞型，分別是ASF1A和ASF1B［5］。研究報道，ASF1B在人胸腺和睪丸中高表達［6］。此外，據報道ASF1B參與了宮頸癌和乳腺癌的發展［7］。然而，ASF1B在PCa中的作用仍不清楚。因此，本項工作應用細胞體外實驗，探討ASF1B在前列腺癌細胞中的表達情況及其對體外細胞增殖能力的影響。

材料和方法

1 細胞培養

人前列腺增生上皮細胞系（良性前列腺增生，benign prostatic hyperplasia，BPH）和前列腺癌PC-3細胞購自ATCC。BPH細胞在含10%胎牛血清（Thermo Fisher Scientifc）、1×105U/L青霉素和 100 mg/L鏈霉素（Sigma-Aldrich）的DMEM培養液（北京索萊寶科技有限公司）中培養。PC-3細胞在含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養液（北京索萊寶科技有限公司）中培養。將所有細胞保持在含有5%CO2的37℃加濕培養箱中。

2 方法

2.1 RNA干擾、轉染與分組 用經過驗證的特異性siRNA進行ASF1B的敲減，siRNA-ASF1B（購自Thermo Fisher Scientific）的正義鏈序列為5'-ACGCAACCCTGTCAGTCTG-3'，反義鏈序列為5'-GGGCAGGTCCACCATTTCC-3'。使用非特異性雜亂siRNA載體作為對照，其正義鏈序列為5'-AGCAGCTAGAATCCCTGGG-3'，反義鏈序列為5'-AGGCCGAAGGAGTTCCAGT-3'。將PC-3細胞以每孔1×104個細胞的密度接種到6孔板中，分為對照（control，Con）組、siRNA陰性對照載體（mock）組和 siRNAASF1B組。對照組不做任何處理；mock組使用Hieff TransTM脂質體轉染試劑（Sigma-Aldrich）和siRNA陰性對照載體（1μg）轉染細胞；siRNA-ASF1B組使用Hieff TransTM脂質體轉染試劑和siRNAASF1B（1μg）轉染細胞。將細胞在37℃下孵育12 h，隨后收集細胞并進行Western blot、RT-qPCR和MTT實驗。

2.2 細胞活力測定 通過MTT法測定細胞活力。將上述處理細胞（1×108/L）接種到96孔培養板中，孵育過夜后，然后向每個孔中加入10μL MTT溶液（在PBS中2.5 g/L），并將板在37℃下再溫育4 h。離心（2 000×g，10 min）后，吸出含有MTT的培養液，然后加入100μL DMSO。用SynergyHT多功能酶標儀（Winooski）在570 nm下測量每個孔的吸光度（A）值。

2.3 Western blot分析 收集細胞在RIPA裂解物緩沖液中裂解，并在冰上進行溫和超聲處理。在BCA定量后，向每個泳道中加入20μg細胞裂解物，隨后通過8%SDS-PAGE（30 mA，120 min）分離，轉移到聚偏二氟乙烯膜上。將膜與I抗［兔抗AKT（1∶800稀釋）、兔抗p-AKT（1∶500稀釋）、兔抗pMAP2K4（1∶1 000稀釋）、兔抗p-ERK（1∶1 000稀釋）、兔抗ERK（1∶1 000稀釋）、兔抗JNK（1∶1 000稀釋）、兔抗p-JNK（1∶1 000稀釋）和兔抗β-actin（1∶1 000稀釋），均購自Cell Signaling Technology］在4℃溫育過夜，然后與抗生物素蛋白-生物素化的辣根過氧化物酶復合物II抗在室溫下溫育2 h。使用Image Lab 5.0軟件（Bio-Rad Laboratories）定量靶蛋白和β-actin的條帶強度，并將每種靶蛋白的強度標準化為相應的β-actin水平。

2.4 RT-qPCR分析 使用RNA提取試劑盒（Promega）提取細胞的總RNA。使用TianScript cDNA Synthesis試劑盒（Tiangen Biotech Co.，Ltd.）將總共1μg的RNA轉錄成cDNA。反應條件如下：85℃5 min，4℃ 5 min。采用SYBR?Premix Ex Taq? II試劑盒（TaKaRa）在ABI 7500 Fast系統（Applied Biosystems）上進行qPCR分析。熱循環設置如下：在92℃下預變性5 min；在92℃變性15 s，在58℃退火30 s，在72?C下延伸35 s，進行30個循環。β-actin用作加載對照。通過2-ΔΔCt計算每個基因的相對表達，并用β-actin進行歸一化。用于qPCR擴增的引物序列如下：p53的正向引物序列為5'-AAGTAGAGAGGCATCGCAGAGA-3'，反向引物序列為5'-TTCGTTGCTGATTTACTCAGTAGG-3'；Bax的正向引物序列為5'-TCCTTCACCAATGTCAACTCC-3'，反向引物序列為5'-TGATTTTTCAGCCCATCCAC-3'；PARP-1的正向引物序列為5'-CTGTCGCTTCTCAATCAGACTC-3'，反向引物序列為5'-CCCAGGTCATTTCCCATCACTT-3'；caspase-3的正向引物序列為5'-CTGCTCTCCCTAACCCCTTGTC-3'，反向引物序列為5'-CACATAGGTAACGAGTCAGAGC-3'；β-actin的正向引物序列為5'-ATCGTGCGTGACATTAAGGAG-3'，反向引物序列為5'-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAG-3'。

2.5 細胞凋亡和細胞周期分析 使用膜聯蛋白VFITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（Sigma-Aldrich）檢查細胞凋亡。將細胞接種在6孔板（每孔3×104細胞）中，置于培養箱培養24 h。然后加入5μL膜聯蛋白VFITC和5 μL PI（50 mg/L）對細胞染色，在室溫下避光孵育20 min。進行BD FACSAria I/II流式細胞術以測量細胞凋亡，并使用BD CellQuest Pro 3.3軟件（均來自BD Biosciences）進行分析。使用PI染料試劑盒（Sigma-Aldrich）進行細胞周期測定。PC-3細胞在通過胰蛋白酶消化收獲并用冷PBS洗滌后，將貼壁細胞在4%的70%乙醇中固定24 h。隨后，將固定的細胞洗滌2次并用含有200μL PBS、1μL PI（1 g/L）和1μL RNase（10 g/L）的循環測試系統在37℃的黑暗中染色20 min。使用流式細胞術分析細胞周期。

3 統計學處理

使用SPSS 19.0和GraphPad Prism 5軟件進行統計分析。數據表示為均數±標準差（mean±SD）。多組間均數比較采用單因素方差分析，然后進行Student-Newman-Keuls多重比較。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 ASF1B在PC-3細胞中的表達

通過Western blot檢測ASF1B在BPH和PC-3細胞中的表達。結果表明，正常細胞（BPH）中ASF1B的蛋白水平顯著低于PC-3細胞（P＜0.01），見圖1。

Figure 1.Western blot was used to detect the ASF1B protein expression in BPH and PC-3 cells.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs BPH group.圖1 Western blot分析BPH和PC-3細胞中ASF1B的蛋白水平

2 siRNA-ASF1B降低PC-3細胞的活力

通過Western blot檢測siRNA-ASF1B質粒在PC-3細胞中的轉染效率。結果顯示，與對照組和mock組相比，用siRNA-ASF1B質粒轉染PC-3細胞后的ASF1B蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01），圖2A。使用MTT法測定PC-3細胞的活力，結果顯示，與對照組和mock組相比，轉染siRNA-ASF1B質粒的PC-3細胞的活力顯著降低（P＜0.01），見圖2B。轉染12 h后，siRNA-ASF1B顯著降低細胞活力，因此將siRNAASF1B轉染持續時間設定為12 h。

3 流式細胞術分析結果

與對照組和mock組相比，轉染siRNA-ASF1B質粒的PC-3細胞的凋亡率顯著升高（P＜0.01），且細胞周期被阻滯于G1期，而G2和S期細胞數量顯著減少（P＜0.01），見圖3。

4 siRNA-ASF1B調節PC-3細胞中的凋亡相關因子

RT-qPCR結果表明，與對照組和mock組相比，用siRNA-ASF1B質粒轉染PC-3細胞后，p53、caspase-3、Bax和PARP-1的mRNA水平上調（P＜0.01），見圖4。

5 siRNA-ASF1B對PC-3細胞中MAPK/JNK/ERK信號通路影響

采用Western blot檢測MAPK/JNK/ERK信號通路的蛋白表達水平。結果顯示，與對照組和mock組相比，siRNA-ASF1B組PC-3細胞中MAP2K4和p-JNK蛋白水平顯著升高（P＜0.01），而p-ERK蛋白水平顯著降低（P＜0.01），見圖5。

Figure 2.Western blot was used to detect the ASF1B protein expression in PC-3 cells after treatment for 12 h（A），and the viability of PC-3 cells was determined by MTT assay at 12，24，and 48 h after treatment（B）.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs Con group；##P＜0.01 vs mock group.圖2 采用Western blot檢測各組處理12 h后PC-3細胞中ASF1B蛋白表達，并采用MTT法測定各組細胞的活力

Figure 3.Flow cytometry was used to analyze the apoptosis（A）and cell cycle distribution（B）of PC-3 cells after treatment for 12 h.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs Con group；##P＜0.01 vs mock group.圖3 流式細胞術分析各組處理12 h后PC-3細胞的凋亡和細胞周期分布

討 論

目前已證實ASF1B對包括乳腺癌細胞和骨肉瘤細胞在內的多種細胞系的增殖為關鍵［7］。ASF1B可能直接上調與DNA復制相關的基因，能夠補償復制缺陷；ASF1B耗盡的細胞顯示出形態改變的細胞核數量以及微核和核間DNA橋的數量顯著增加［6］。這些研究表明ASF1B在有絲分裂過程中可能起作用。本研究顯示，正常細胞（BPH）中ASF1B的蛋白水平顯著低于PC-3細胞，這一結果與乳腺癌和宮頸癌中ASF1B的高表達相似［7］，提示ASF1B上調可能有助于PCa的生長、轉移和分化。

Figure 4.RT-qPCR was used to analyze the mRNA expression of p53，caspase-3，Bax and PARP-1 in PC-3 cells.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs Con group；##P＜0.01 vs mock group.圖4 RT-qPCR分析PC-3細胞中p53、caspase-3、Bax和PARP-1的mRNA水平

Figure 5.Western blot was used to detect the effect of siRNA-ASF1B on MAPK/JNK/ERK signaling pathway in PC-3 cells.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs Con group；##P＜0.01 vs mock group.圖5 Western blot檢測siRNA-ASF1B對PC-3細胞中MAPK/JNK/ERK信號通路的影響

抗腫瘤藥物和基因在促進腫細胞凋亡過程中發揮作用［8］。先前的一項研究表明，ASF1B的過度表達顯著增強了乳腺癌的增殖［9］。本研究中，與對照細胞相比，siRNA-ASF1B顯著下調了PC-3細胞的ASF1B表達，與此同時細胞凋亡率顯著增加。細胞凋亡與細胞周期分布有關。凋亡的變化參與細胞周期階段的調節，包括G1、G2和S期［10-12］。類似地，本研究數據顯示，siRNA-ASF1B誘導PC-3細胞G1期阻滯，表明ASF1B沉默可促進PCa的細胞周期阻滯。為了進一步驗證siRNA-ASF1B對細胞凋亡的抑制作用，我們檢測了細胞凋亡相關因子的表達情況。結果顯示，用siRNA-ASF1B質粒轉染PC-3細胞后p53、caspase-3、Bax和PARP-1的mRNA水平上調［13-14］。這些結果表明，ASF1B的敲減通過提高p53、caspase-3、PARP和Bax的表達水平，加速了PC-3細胞的凋亡。

MAPK/JNK/ERK信號通路在細胞生長和增殖中起作用，并且已經觀察到該通路在各種癌癥類型中失調［15］。此外，抑制MAPK/JNK信號通路導致細胞活力降低，并可能增強 PCa的凋亡［16］，表明 MAPK/JNK信號通路在腫瘤進展過程中的作用。本研究中，siRNA-ASF1B組中PC-3細胞的MAP2K4和p-JNK蛋白水平顯著升高（P＜0.01），表明ASF1B的敲減激活了MAPK/JNK途徑，進而誘導細胞凋亡。另一方面，已知ERK1/2的激活能有效促進細胞存活［1］。本研究顯示，p-ERK蛋白水平顯著降低。這些結果強烈提示，ASF1B的沉默抑制了PCa的存活。因此，激活MAPK/JNK/ERK信號通路可能是siRNA-ASF1B在PCa中抗腫瘤作用的潛在機制之一。

總之，本研究結果表明ASF1B在PC-3細胞中高度上調；ASF1B沉默顯著誘導PC-3細胞G1期阻滯，促進細胞凋亡；激活MAPK/JNK/ERK信號通路可能是siRNA-ASF1B抗腫瘤作用的機制之一。