仔豬腹瀉病原菌多重PCR檢測方法的建立

申 湖 黃 利

（大方縣農業農村局，貴州大方 551600）

1 材料

1.1 菌株

大腸桿菌、沙門氏菌、志賀桿菌三種細菌均由貴州省動物疫病研究室提供。

1.2 試劑

普通營養瓊脂培養基、鮮血營養瓊脂培養基、麥康凱瓊脂培養基、伊紅美藍培養基、膽硫乳培養基、三糖鐵培養基、LB液體培養基，購自杭州微生物試劑有限公司。

2 方法

2.1 試劑配制

2.1.1 固體培養基

稱取胰蛋白胨10g；酵母提取物5g；NaCl 10g；瓊脂粉15g依次放入錐形瓶中加入蒸餾水至1000ml，加熱溶液至溶液沸騰。將錐形瓶包裝好后放入高壓滅菌鍋中進行121℃高壓滅菌30min，滅菌后將溶液傾倒無菌平板即可，制作好的平板置于4℃冰箱保存待用。

2.1.2 液體培養基

稱取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，依次放入錐形瓶中加入蒸餾水至1000 ml，用電熱爐加熱至沸騰待容易呈清亮透明時即可，最后將錐形瓶包裝好后放入121℃高壓滅菌30min。

2.1.3 瓊脂糖凝膠

稱取1.5g瓊脂糖于100ml錐形瓶中，向瓶內加入TBE至100ml，在電熱爐上將其加熱煮沸待溶液清亮透明時即可。待溶液冷卻至50～60℃時加入7μl核酸染料混勻，將配制好的電泳凝膠溶液傾倒膠槽中，待其徹底冷卻方可使用。

2.2 引物設計與合成

針對大腸埃希菌23S rRNA基因、沙門氏菌invA基因和志賀桿菌的ipaH基因，用 Premier 5.0軟件設計上下游引物，引物由英俊公司合成。

2.3 細菌DNA提取

將實驗室保存的已分離鑒定的大腸桿菌、沙門氏菌、志賀桿菌用接種環接種到新的LB液體培養基中，于37℃恒溫振蕩培養箱中培養，用于DNA提取。

（1）從保存的離心管中取新的離心管并標上大腸桿菌、沙門氏菌、志賀桿菌字樣然 后從純化培養過的大腸桿菌、沙門氏菌、志賀桿菌試管中分別取2ml菌液加入到標記的離心管內，10000.rpm離心1min然后用移液槍吸掉或直接倒掉上清液，得到菌體沉淀。

（2）用移液槍分別向所獲得的菌體沉淀離心管中加入200μl緩沖液GA，利用振蕩儀充分震蕩混勻至菌體沉淀徹底懸浮。

（3）向離心管中分別加入20 μlproteinaseK溶液然后上下顛倒使溶液充分混勻。

（4）往離心管中加入220 μl緩沖液GB振蕩15s，70℃放置10 min這時溶液應變清亮，簡短離心以去除離心管管蓋內壁的水珠。

（5）向離心管內各加入無水乙醇220 μl，利用微量震蕩器充分振蕩溶液使其混勻，此可能會出現絮狀沉淀，為了去除管蓋內壁的水珠可以用微量離心機離心。

（6）將上一步所獲得的絮狀沉淀及其溶液轉移到三個吸附柱CB1、CB2、CB3中，并將吸附柱放入到收集管內，12000 rpm離心30s，傾倒掉廢液并把吸附柱放回到收集管內

（7）向三支吸附柱中分別加入500 μl緩沖液GD，12000 rpm離心30s然后倒掉廢液并把吸附柱重新放回收集管內

（8）往三支吸附柱中分別加入600 μl漂洗液PWC，12000 rpm離心30s，傾倒掉上層廢液并把吸附柱放回收集管內

（9）繼續步驟8

（10）將三支吸附柱放回收集管內，12000 rpm空柱離心2 min并傾倒掉廢液，將三支吸附柱室溫靜置5 min。

（11）把三支吸附柱分別放入三支新的收集管中，向吸附柱中間部位懸空滴加50～200μl的洗脫緩沖液TE，室溫靜置5 min，然后12000 rpm離心2 min并將所得溶液收集到離心管內。

表2 引物序列表

2.4 多重PCR檢測方法的建立

2.4.1 單重PCR檢測

分別以大腸埃希菌、志賀桿菌和沙門氏菌菌株DNA為模板進行PCR擴增，總體積25μlPCR反應體系，結束后用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳。反應條件和體系見表3

表3 單重PCR反應體系

表4 單重PCR反應條件

2.4.2 多重PCR擴增

按照實驗步驟2.4的方法提取大腸桿菌、沙門氏菌和志賀桿菌的DNA模版，將提取的三種細菌的DNA模版按大腸桿菌DNA：沙門氏菌DNA：志賀桿菌DNA=1：1：1等量混勻并以混勻的三種菌的DNA 作為模版進行目的基因的擴增反應體系見表5，反應條件見表6。

表5 單重PCR反應體系

表6 單重PCR反應條件

2.4.3 多重PCR反應引物濃度的優化（表7）

2.4.4 多重PCR反應退火溫度的優化

應用上一步的最佳引物濃度和各退火溫度組合對多重PCR退火溫度進行優化，優化退火溫度從51～60℃共10個梯度。從中優化出多重PCR反應體系的最佳退火溫度。PCR擴增后經1.2%瓊脂糖凝膠電泳。

2.4.5 多重PCR反應敏感性實驗

利用步驟2.3提取的DNA模版經核酸蛋白測定儀對3種細菌基因組DNA樣本進行濃度測定，并分別進行10倍梯度稀釋，取各稀釋度樣本進行PCR擴增。檢驗多重PCR最佳靈敏度。

表7 引物濃度梯度表

2.4.6 多重PCR反應特異性實驗

以大腸桿菌、沙門氏菌、志賀桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、巴氏桿菌等細菌混合DNA為模板，同時加入3對引物進行擴增；同時加入3對引物進行PCR擴增。然后經1.2%的瓊脂糖凝膠電泳觀察

3 實驗結果

3.1 單重PCR反應體系的建立

對大腸桿菌、沙門氏菌、志賀桿菌三種細菌單一模版進行單重PCR擴增。

圖1 單重PCR反應的建立

由圖1可以看出大腸桿菌、沙門氏菌、志賀桿菌三種菌PCR擴增分別在652bp、184bp、393bp時得到清晰明亮的條帶，說明，本次試驗所研究設計的3對引物特異性較好，表明研究設計的三對引物能夠應用到之后的多重PCR檢測方法的建立。

3.2 多重PCR退火溫度優化

選擇51～60℃進行溫度梯度PCR擴增，結果見圖2

如圖2所示，多重PCR均能得到清晰明亮目的條帶，其中第5泳道的條帶最明亮，因此選擇55℃作為本研究試驗的最佳退火溫度。

3.3 多重PCR引物濃度優化

選擇引物添加量分別為0.25μl、0.5μl、0.75μl、1μl、1.25μl、1.5μl、1.75μl、2μl、2.25μl、2.5μl，按所加引物濃度梯度進行PCR擴增，擴增結果見圖3。

圖2 多重PCR反應退火溫度的優化

圖3 多重PCR反應引物濃度的優化

如圖3所示均得到目的條帶但4泳道的條帶最清晰因此選擇引物添加量為1 μl即引物濃度為0.4 μmol/L作為最佳引物濃度

3.4 多重PCR敏感性試驗

將初始三種DNA模板濃度分別稀釋，然后跑三重PCR結果見圖4。

圖4 多重PCR反應敏感性試驗

由圖4可見，設計模版稀釋梯度為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9。 圖中第 8 泳道的條帶最為暗淡，所以 多重PCR同時檢測沙門氏菌、志賀氏菌和大腸桿菌靈敏度為10-8CFU/ml。

3.5 多重PCR特異性試驗

分別對大腸桿菌、沙門氏菌、志賀桿菌3種細菌混合模版、單一模版及其他細菌的單一模版進行多重PCR擴增結果見圖5。

特異性試驗所建立多重PCR能夠對3種細菌混合模版、單一模版擴增出清晰明亮的目的條帶，未能擴增出其他細菌的任何目的條帶，表明所建立的方法特異性良好。

4 討論與分析

影響PCR反應的因素有很多，引物的特異性、穩定性、PCR反應引物的濃度、PCR體系的退火溫度、DNA模版的含量和質量以及各個DNA模版之間相互影響等都會影響到檢測的效果，因此可以從影響反應的因素出發，通過選擇適當條件因素進行PCR反應來建立能夠快速精確地檢測出致病菌的檢測方法。

而本次試驗針對志賀桿菌ipaH的基因、大腸埃希菌23S rRNA基因和沙門氏菌invA基因分別設計合成了3對特異性引物。通過對大腸桿菌、沙門氏菌、志賀桿菌進行單重PCR擴增，在凝膠成像儀上可以看出設計的三對引物擴增的條帶都比較清晰明亮，表明研究設計的三對引物具有較好的特異性和穩定性。通過不同的引物濃度梯度對模版DNA進行PCR擴增從中優化出最佳引物濃度，再用最佳引物濃度應用到多重PCR體系，選擇不同的退火溫度梯度對模版DNA進行PCR擴增，從而優化出最佳退火溫度。通過對引物濃度及退火溫度的優化極大的減少了PCR擴增誤差，增加了實驗結果的準確性。經過隨機選取大腸桿菌、沙門氏菌、志賀桿菌等6種細菌菌株進行特異性實驗，結果表明本研究試驗設計的多重PCR檢測方法具有良好的特異性和準確性。整個檢測的過程所需時間極大縮短、準確度得到了很大的提高，這能夠為疾病的控制和治療節約大量的時間。

圖5 多重PCR反應特異性試驗