臭氧化0.9%氯化鈉溶液瘤內注射對兔VX2 腫瘤低氧誘導因子-1α、 血管內皮細胞生長因子表達及微血管密度形成的影響

羅 榮， 王凌霄， 劉 航， 楊朝愛， 江 旭， 楊繼金

臭 氧 又 稱“活 性 氧”,Sweet 等［1］1980 年 研 究 發現它在一定濃度范圍內可選擇性抑制腫瘤細胞生長,對正常細胞無影響或影響輕微。 研究表明臭氧具有極強的氧化性,可改善腫瘤缺氧狀態,其效果與腫瘤內基礎氧分壓呈負相關,腫瘤內氧分壓低于5 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）時效果最佳［2-3］。 魏強等［4］在瘤內注射臭氧致瘤組織超微結構改變的實驗中發現,一定濃度臭氧可對腫瘤細胞及瘤內血管內皮細胞造成損傷。 然而目前關于臭氧治療腫瘤時對腫瘤內低氧誘導因子（HIF）-1α、血管內皮細胞生長因子（VEGF）及微血管密度（MVD）影響的研究報道較少。本研究對此進行探討,現將實驗結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性新西蘭大白兔90 只,體重2～2.5 kg,由海軍軍醫大學海軍醫學研究所提供,動物合格證編號SCXK（滬）20150005；飼養條件為單籠單兔,自由攝食,室內溫度（22±2）℃,濕度（70±5）%,每天12 h（7∶00～19∶00）光照。

1.2 兔VX2 腫瘤模型制備

兔適應性飼養3～5 d 后種植VX2 腫瘤:VX2瘤株來自第二軍醫大學附屬長海醫院核醫學科傳代瘤兔,自傳代瘤兔左后腿取出后于0.9%氯化鈉溶液中洗滌2～3 次,去除表面血漬,無菌手術刀切開瘤塊,去除中心壞死部分,取邊緣魚肉樣組織作為活性腫瘤組織, 無菌眼科剪將活性腫瘤組織剪碎,大小約為1 mm3,備用；用3%戊硫代巴比妥鈉（0.8～1 mL/kg）沿兔耳緣靜脈緩慢注入進行麻醉,兔仰臥位固定于專用手術臺上,于左后腿內側肌肉處備皮、消毒、鋪巾后,用無齒鑷提起皮膚、剪一長約5 mm 小口,鈍性逐層分離皮下筋膜,暴露皮下肌肉組織, 再用無齒鑷提起肌肉, 剪一長約5 mm 小口,將備用瘤塊置入肌肉傷口內,縫合肌肉和皮膚后消毒并放入籠中飼養。 10～12 d 后,超聲檢測腫瘤大小,腫瘤長徑長至1～1.5 cm 時進行實驗。

1.3 臭氧化0.9%氯化鈉溶液制備

實驗前24 h 將所需0.9%氯化鈉溶液（無菌透明玻璃瓶儲存,劑量30 mL）置于4℃冰箱保存,實驗開始前0.5 h 制作臭氧化0.9%氯化鈉溶液時取出；將臭氧發生器輸出濃度調至20 μg/mL,臭氧氣體輸出速率為3 L/min,通過輸液管道通入備用0.9%氯化鈉溶液中,持續時間為20 min。 制作至實驗結束過程中玻璃瓶周圍仍放置多個冰袋維持其低溫狀態,制作完成后用臭氧濃度測定試劑盒檢測水中臭氧濃度。本實驗所用臭氧化0.9%氯化鈉溶液中臭氧濃度為0.25～0.5 mg/L。

1.4 動物分組與處理方法

選擇符合條件的瘤兔72 只,隨機均分為4 組（A、B、C、D 組）,各18 只。 按上述方法麻醉后,聚維酮碘消毒腫瘤部位,超聲檢測腫瘤大小,記錄腫瘤最大切面長徑（a）和相垂直的短徑（b）,按公式V＝1/2ab2計算腫瘤體積。超聲導引下,A 組注射2 倍腫瘤體積的0.9%氯化鈉溶液1 次、B 組注射2 倍腫瘤體積的臭氧化0.9%氯化鈉溶液1 次、C 組注射2 倍腫瘤體積的臭氧化0.9%氯化鈉溶液連續2 次（1 次/d, 連續2 d）、D 組注射2 倍腫瘤體積的臭氧化0.9%氯化鈉溶液連續3 次（1 次/d,連續3 d）,緩慢推注,避免腫瘤內壓力過大脹破腫瘤包膜,同時禁忌反復穿刺腫瘤,以免發生針道種植轉移。 注射完成后觀察1 h,如無異常,放入籠中繼續飼養。 術后第4、8、12 天, 各組隨機選取6 只兔經耳緣靜脈注射空氣15～20 mL 處死, 切取腫瘤浸泡于4%甲醛溶液。

1.5 瘤組織內HIF-1α、VEGF 和MVD 檢測

采用免疫組化法檢測腫瘤內CD31 標記的MVD 及HIF-1α、VEGF 表達: 免疫組化染色完成后,將每張切片于高倍鏡（×200）視野下選取染色最為集中處拍照并將圖像輸入Image-Pro Plus 6.0 生物醫學影像分析系統進行染色強度即累積吸光度（IOD）檢測,記錄單位面積IOD 值；4%甲醛固定腫瘤標本沖洗干凈,脫水、包埋、切片（厚3 μm）、烤片、脫蠟、水化,pH6.0 檸檬酸鹽緩沖液加入染色盒,放入緩沖液高溫高壓處理10 min,染色盒于室溫下自然冷卻,蒸餾水沖洗2 次后磷酸緩沖液（PBS）洗3 min×3 次,3%H2O2室溫孵育10 min,PBS 洗3 min×3 次, 加入100 μL 血清封閉液, 室溫孵育10 min,PBS 洗3 min×3 次,加入一抗（美國Novus 生物制品公司）,孵育過夜,PBS 洗3 min×3 次,加入一抗增強劑,室溫孵育30 min 后PBS 洗3 min×3 次,滴加即用型二抗,室溫避光孵育30 min,PBS 洗3 min×3 次,以二氨基聯苯胺（DAB）顯色,蒸餾水沖洗、復染、脫水、封片。

1.6 統計學方法

采用SSPS 21.0 軟件進行統計學分析。 計量資料以均數±標準差（x±s）表示,多組比較用方差分析,組間兩兩比較用LSD-t 檢驗。 P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

各組不同時間點瘤組織內HIF-1α 表達比較見表1、圖1。 術后第4、8 天B 組瘤組織內HIF-1α 表達低于A 組,術后第12 天略高于A 組,但差異均無統計學意義（P＞0.05）；術后C、D 組瘤組織內HIF-1α表達均高于A 組,C 組更明顯, 第12 天C 組與A、B、D 組間差異均有統計學意義（P＜0.05）,余各組間于同一時間節點差異均有統計學意義（P＜0.05）。

表1 各組不同時間點瘤組織內HIF-1α 表達比較 x±s

圖1 各組第12 天腫瘤內HIF-1α 表達(目鏡×物鏡，10×20 倍)

各組不同時間點瘤組織內VEGF 表達比較見表2、 圖2。 術后第4 天B 組、C 組瘤組織內VEGF表達稍低于A 組,其余時間節點及D 組瘤內VEGF表達均高于A 組, 且在第8 天C、D 組與A 組間差異均有統計學意義（P＜0.05）,余同一時間節點各組間差異均無統計學意義（P＞0.05）。

各組不同時間點瘤組織內CD31 標記的MVD比較見表3。 與A 組相比,術后第4、8 天B 組瘤組織內MVD 形成減少,術后第12 天略增高,但差異均無統計學意義（P＞0.05）。 C 組瘤組織內MVD 形成在各時間節點均高于A、B、D 組, 但差異均無統計學意義 （P＞0.05）； 術后第4 天D 組瘤組織內MVD 形成高于A 組, 第8 天和第12 天低于A 組,但差異均無統計學意義（P＞0.05）。

表2 各組不同時間點瘤組織內VEGF 表達比較 x±s

表3 各組不同時間點瘤組織內CD31 標記的MVD 比較x±s

圖2 各組第8 天腫瘤內VEGF 表達(目鏡×物鏡，10×20 倍)

3 討論

缺氧是腫瘤組織的重要生物學特征之一。 腫瘤細胞快速分裂增殖導致大量腫瘤細胞遠離血管,使得腫瘤細胞處于缺氧環境,長期缺氧將誘導腫瘤細胞產生HIF-1α［5］。 在正常氧飽和度情況下,HIF-1α在細胞質中被脯氨酸羥化酶滅活而處于失活狀態,而在缺氧狀態、氧化應激時,脯氨酸羥化酶被抑制,HIF-1α 不能被滅活而與HIF-1β 結合形成異源型二聚體并進入細胞核, 異源型二聚體與DNA 分子上缺氧反應元件結合, 從而調節某些基因,使VEGF、促紅細胞生成素、糖酵解酶表達增多。 VEGF表達增多可促進血管形成,從而促進腫瘤細胞增殖和存活［6］,使腫瘤發生遠處轉移的風險增加。 因此,改善腫瘤缺氧狀態有可能促進HIF-1α 滅活,使VEGF 表達減少,腫瘤血管形成減少,從而改善腫瘤患者預后。

臭氧又稱為“活性氧”,由3 個氧原子構成,在常溫常壓下是一種淡藍色、有魚腥臭味的刺激性氣體,1840 年由德國科學家Schonbein 發現［7］。 它具有強氧化性, 其氧化性僅次于氟和羥基, 對細菌、病毒、真菌等病原微生物具有極強的殺滅作用,同時可改善局部血液循環,增加局部氧供［8］。早期研究表明, 腫瘤缺血缺氧將會增加其對放化療的抵抗性,嚴重影響預后,因此減輕腫瘤缺氧對改善預后有重要作用［9-10］。 臭氧可改善腫瘤缺血缺氧狀態,尤其是在腫瘤內氧分壓低于5 mmHg 時效果最佳［2-3］,使到達腫瘤局部的化療藥物或放療增敏劑等增多,從而增強放化療效果；且實驗研究亦表明單一臭氧療法或臭氧聯合放化療及光動力療法可明顯降低腫瘤細胞活性或抑制腫瘤生長［11-15］。

本研究結果顯示,連續多次注射臭氧化0.9%氯化鈉溶液可能導致腫瘤內HIF-1α、VEGF 表達增加,MVD 形成增多, 其原因可能為短時間內連續多次臭氧化0.9%氯化鈉溶液瘤內注射加重腫瘤內已有氧化應激,從而抑制脯氨酸羥化酶活性,導致腫瘤內HIF-1α 滅活減少,VEGF 表達增多, 促進腫瘤微血管生成,促進腫瘤生長。 本實驗療效部分研究也發現,與單次臭氧化0.9%氯化鈉溶液瘤內注射組相比,多次注射對腫瘤生長抑制效果較差（另文發表）。 已有研究表明,臭氧濃度過高或劑量過大可能會加重原已存在的氧化應激,而臭氧治療用途主要是通過適度的氧化應激激發機體各種反應,如抗氧化還原反應、免疫反應等［16-17］。本研究結果還顯示單次臭氧化0.9%氯化鈉溶液瘤內注射,雖可使腫瘤組織內HIF-1α、VEGF 表達及MVD 形成呈下降趨勢,但并無明顯統計學意義；分析其原因可能為樣本量不足或所用臭氧濃度/劑量過低,或為治療劑量臭氧對腫瘤內HIF-1α、VEGF 表達及MVD 形成無明顯影響。 然而Guclu 等［18］研究臭氧療法治療糖尿病性腎病對HIF-1α、 腫瘤壞死因子（TNF）-α 等表達的影響,發現50 μg/mL 臭氧可使病變組織內HIF-1α 表達下調。 Jin 等［19］研究臭氧對鼻咽癌放療患者血清HIF-1α、VEGF 水平的影響,發現10～20 μg/mL 臭氧（100 mL）可下調血清中HIF-1α、VEGF 水平。因此,下一步擬通過增加樣本量、改變臭氧濃度和劑量等方面研究臭氧對腫瘤內HIF-1α、VEGF 水平及MVD 形成的影響,以期更加全面地評估其對改善腫瘤乏氧的可能性。

綜上所述,本研究認為臭氧化0.9%氯化鈉溶液瘤內單次注射對腫瘤組織內HIF-1α、VEGF 表達及MVD 形成無明顯影響, 但多次注射可能導致HIF-1α、VEGF 高表達,MVD 形成呈增加趨勢。但確切機制還需進一步研究。