下肢動脈硬化閉塞癥患者介入治療后血清miR-342-5p 水平及其意義

杜自忠， 王 晨， 張明星， 靳金龍， 趙 丹， 馬書平， 白會玲， 章 立

隨著生活方式改變和人口老齡化,下肢動脈硬化閉塞癥發(fā)病率逐年升高,我國老年人群罹患率為10%左右［1］。 該病是導(dǎo)致下肢截肢的主要原因之一,占所有截肢患者40%～60%［2］。 血管旁路移植手術(shù)和介入治療為目前下肢動脈硬化閉塞癥有效治療方法,但血管旁路手術(shù)創(chuàng)傷較大,不適合年齡較大患者,介入治療具有創(chuàng)傷小、術(shù)后恢復(fù)快、并發(fā)癥少等優(yōu)點(diǎn),臨床上已廣泛應(yīng)用［3］。介入治療近期療效較好,但仍有部分患者術(shù)后發(fā)生再狹窄或需截肢等［4］。因此,早期了解患者預(yù)后情況、采取合理干預(yù)措施、改善患者預(yù)后至關(guān)重要。 目前臨床上尚缺乏靈敏、準(zhǔn)確的生物標(biāo)記物評估下肢動脈硬化閉塞癥患者介入治療預(yù)后情況。 微小核糖核酸（microRNA,miRNA,miR）-342-5p 已證實(shí)可通過抑制蛋白激酶B 介導(dǎo)的miR-155 表達(dá)參與 動脈粥樣硬化過程［5］,但關(guān)于miR-342-5p 與下肢動脈硬化閉塞癥患者介入治療預(yù)后的關(guān)系未見報道。 為此,本中心開展此項(xiàng)研究,旨在為下肢動脈硬化閉塞癥患者介入治療預(yù)后評估提供參考。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2015 年3 月至2018 年3 月甘肅省中醫(yī)院救治的195 例下肢動脈硬化閉塞癥患者作為研究對象。 根據(jù)《下肢動脈硬化閉塞癥診治指南》［6］中的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷:①下肢涼、麻木、無力、間歇性跛行和靜息痛,肢體缺血性潰瘍、壞疽等；②缺血肢體遠(yuǎn)端動脈搏動減弱或消失；③踝-肱指數(shù)＜0.9；④趾-肱指數(shù)＜0.7。 患者納入標(biāo)準(zhǔn):①下肢血管CTA 顯示狹窄程度≥50%；②未接受過對癥治療；③愿接受介入治療,年齡≥18 歲；④簽署知情同意書。 排除標(biāo)準(zhǔn):①伴有惡性腫瘤； ②術(shù)后不能堅(jiān)持口服抗血小板藥物；③有嚴(yán)重肝、腎損害；④既往有下肢損傷史；⑤既往下肢手術(shù)史；⑥糖尿病足。195 例患者中男113 例,女92 例；年齡40～72 歲,平均（57.43±4.93）歲；體質(zhì)指數(shù)（BMI）為（27.17±3.09） kg/m2。 本研究獲得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

抽取患者介入術(shù)前及術(shù)后12 h 空腹外周靜脈血10 mL,室溫下4 000 r/min 離心15 min,離心半徑8 cm,分離上層血清,置于-20℃冰箱待測。 采用免疫比濁法檢測血清C 反應(yīng)蛋白（CRP）水平（試劑盒購自北京奧維亞生物技術(shù)公司）。

采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative PCR,RT-PCR）［7］檢測患者血清miR-342-5p 相對表達(dá),TRIzol 試劑（美國Thermo公司）提取總RNA,TaqMan microRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Thermo 公司）合成cDNA,PCR 擴(kuò)增。 反應(yīng)條件為:95℃60 s,95℃15 s,15 s 退火,72℃45 s,40 個循環(huán)。以β-肌動蛋白（actin）為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt 表示miR-342-5p 相對表達(dá)。 基因序列:miR-342-5p 為F:5'-CCACATTTAAAGGACTGTAT-3',R:5'-AAAAAGCCACATTTAAAGGAC-3'；β-actin 為F:5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3',R:5'-GTCAGTCGCTTGGGCTGT-3'。

介入術(shù)后通過電話隨訪或復(fù)診等方式進(jìn)行隨訪（2015 年3 月24 日至2019 年4 月15 日）,記錄患者術(shù)后12 個月內(nèi)預(yù)后情況。 術(shù)后再狹窄、截肢和死亡,定義為預(yù)后不良。 下肢彩色超聲或CT 復(fù)查血管狹窄＞50%,定義為再狹窄［8］。

根據(jù)CRP 和miR-342-5p 評估介入治療預(yù)后的最佳截?cái)帱c(diǎn),將其轉(zhuǎn)換為二分類變量。 將伴高血壓（否=0,是=1）、伴糖尿病（否=0,是=1）、伴高脂血癥（否=0,是=1）、伴高同型半胱氨酸血癥（否=0,是=1）、吸煙史（否=0,是=1）、泛大西洋學(xué)會聯(lián)盟（TASC）分型（A、B 型=0,C、D 型=1）以及CRP（＜4.27 g/L=0,≥4.27 g/L=1）、miR-342-5p（＜1.23=0,≥1.23=1）作為自變量,預(yù)后情況（預(yù)后良好=0,預(yù)后不良=1）作為因變量納入logistic 回歸分析。

采用二元logistic 回歸分析建立介入治療預(yù)后評估模型A（F=-203.934+0.883×伴糖尿病+0.832×伴高脂血癥+0.657×吸煙史-0.735×TASC 分型+2.824×CRP）和模型B（F=-204.267+0.832×伴糖尿病+0.810×伴高脂血癥+0.837×吸煙史+0.862×TASC 分型+2.911×CRP+5.704×miR-342-5p）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 服從正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示,兩組間比較用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn),治療前后比較用配對樣本t 檢驗(yàn)。 計(jì)數(shù)資料用卡方檢驗(yàn),以例或率［n（%）］表示。Logistic 回歸法分析影響下肢動脈硬化閉塞癥患者介入術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)因素。 受試者工作特征曲線（ROC）分析miR-342-5p、模型A、模型B 評估下肢動脈硬化閉塞癥患者介入術(shù)后復(fù)發(fā)的效能。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

介入治療術(shù)后195 例患者中預(yù)后良好160 例（82.1%,預(yù)后良好組）,預(yù)后不良35 例（17.9%,預(yù)后不良組）,其中25 例（12.8%）發(fā)生再狹窄,8 例（4.1%）截肢,2 例（1.0%）死亡。 兩組患者間年齡、性別、BMI、伴腦血管病、伴冠心病、伴慢性腎功能不全、病變肢數(shù)比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；伴高血壓、伴糖尿病、伴高脂血癥、伴高同型半胱氨酸血癥、吸煙史、TASC 分型、CRP 比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）,見表1。 兩組血清miR-342-5p 相對表達(dá)比較,治療前差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）,治療后均降低, 預(yù)后良好組降低幅度大于預(yù)后不良組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）,見表2。

表1 兩組患者基本資料比較

表2 兩組介入治療前后血清miR-342-5p 相對表達(dá)比較fmol/L

Logistic 多因素回歸分析結(jié)果顯示, 伴糖尿病、伴高脂血癥、吸煙史、TASC 分型、CRP、miR-342-5p與下肢動脈硬化閉塞癥患者介入治療預(yù)后密切相關(guān),見表3。 二元回歸分析顯示,miR-342-5p 評估介入治療預(yù)后曲線下面積（AUC）與模型A 比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=0.078,P=0.938）；模型B 評估介入治療預(yù)后AUC 高于miR-342-5p 和模型A,差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=2.683,P=0.007；Z=4.624,P＜0.001）,見表4～6,圖1。

表3 影響介入治療預(yù)后的多因素分析結(jié)果

表4 模型A 預(yù)測介入治療預(yù)后的二元分析結(jié)果

表5 模型B 預(yù)測介入治療預(yù)后二元分析結(jié)果

3 討論

下肢動脈硬化閉塞癥由動脈粥樣硬化斑塊形成引起,若不能及時處理,截肢率較高［9］。 介入治療為目前臨床廣泛應(yīng)用的一種微創(chuàng)手術(shù),雖取得一定療效,但術(shù)后再狹窄或截肢等情況時有發(fā)生。 因此,下肢動脈硬化閉塞癥患者介入術(shù)后預(yù)后評估,對改善患者預(yù)后具有重要意義。miRNA 是一種非編碼單鏈RNA, 研究顯示miRNA 多方面參與動脈粥樣硬化進(jìn)展,如內(nèi)皮功能障礙、炎性細(xì)胞浸潤、低密度脂蛋白氧化等［10-12］。 miR-342-5p 在早期巨噬細(xì)胞病變中高表達(dá),動物模型和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均表明miR-342-5p參與動脈粥樣硬化發(fā)生過程［5］。 本研究旨在探討miR-342-5p 與下肢動脈硬化閉塞癥患者介入治療預(yù)后的關(guān)系。

表6 miR-342-5p、模型A 和模型B 評估介入治療預(yù)后效能

圖1 miR-342-5p、模型A 和模型B 評估介入治療預(yù)后的ROC 曲線

本研究顯示,介入治療前下肢動脈硬化閉塞癥患者血清miR-342-5p 相對表達(dá)高于治療后, 表明miR-342-5p 可能與下肢動脈硬化閉塞癥患者病情存在聯(lián)系； 預(yù)后不良組患者血清miR-342-5p 相對表達(dá)高于預(yù)后良好組, 表明miR-342-5p 可能與患者預(yù)后存在聯(lián)系。Logistic 回歸分析影響下肢動脈硬化閉塞癥患者介入治療預(yù)后因素顯示, 伴高血壓、伴糖尿病、伴高脂血癥、吸煙史、TASC 分型與介入治療預(yù)后密切相關(guān), 該結(jié)果與既往研究一致［13-14］；miR-342-5p 與患者介入治療預(yù)后密切相關(guān)。

炎性因子介導(dǎo)的動脈粥樣硬化與下肢動脈硬化閉塞癥發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［15］。 研究表明,蛋白激酶B 可通過激活核因子κB 上調(diào)巨噬細(xì)胞過表達(dá)一氧化氮合酶-2［16］。 一氧化氮合酶-2 表達(dá)升高,促進(jìn)血管壁中一氧化氮和超氧化物反應(yīng)生成氧化亞硝酸鹽,通過此途徑引起高脂蛋白硝化反應(yīng)及多條代謝信號通路失調(diào),導(dǎo)致代謝產(chǎn)物在血管聚集［17］。 此外,一氧化氮合酶-2 還可引起炎性細(xì)胞浸潤,通過炎性反應(yīng)損傷血管內(nèi)皮, 引起血管內(nèi)血栓形成［18］。有研究表明, 通過抑制大鼠miR-342-5p 表達(dá)可減少一氧化氮合酶-2 介導(dǎo)的過氧亞硝酸鹽形成［5］。 因此, 本研究推測miR-342-5p 可能通過促進(jìn)一氧化氮合酶-2 表達(dá), 參與下肢動脈硬化閉塞癥疾病進(jìn)展。 但關(guān)于miR-342-5p 影響下肢動脈硬化閉塞癥疾病進(jìn)展的病理生理機(jī)制,仍需進(jìn)一步探究。

本研究同時應(yīng)用miR-342-5p、模型A 和模型B評估下肢動脈硬化閉塞癥患者介入治療預(yù)后,結(jié)果顯示模型B 評估介入治療預(yù)后效能高于miR-342-5p 和模型A, 表明增加miR-342-5p 更有利于下肢動脈硬化閉塞癥患者介入治療預(yù)后的評估。

綜上所述,miR-342-5p 與介入治療后下肢動脈硬化閉塞癥患者預(yù)后密切相關(guān),檢測血清miR-342-5p 相對表達(dá)有助于評估患者介預(yù)后情況。 本研究下一步將動態(tài)檢測下肢動脈硬化閉塞癥患者血清miR-342-5p 相對表達(dá), 并分析miR-342-5p影響下肢動脈硬化閉塞癥疾病進(jìn)展的病理生理機(jī)制。