糜子溶磷內生真菌的篩選及其鑒定

楊 剛，余仲東，趙世偉,3，郭威震，李 喆

(1.西北農林科技大學 資源環境學院,陜西 楊凌 712100;2.西北農林科技大學 林學院,陜西 楊凌 712100;3.西北農林科技大學 水土保持研究所,陜西 楊凌 712100)

糜子(Panicummiliaceum)最早發源于中國，相較于其他農作物具有更悠久的歷史。經過長期的自然選擇和栽培馴化，糜子越來越能夠適應干旱、半干旱地區的貧瘠和干涸，這使得它具有了抗旱、耐貧瘠的優點，并且由于它對氮、磷等營養元素的吸收性好而且生育期很短，使它成為了如今干旱、半干旱地區的主要農作物之一,在解決糧食問題的同時，糜子更為干旱、半干旱帶來較為可觀的經濟效益，這使它成為了國家和人民重點種植推廣的作物，并成為了我國抗災備荒、增產增收必不可卻的農作物[13-15]。近年來，由于干旱、半干旱地區磷肥及一些高濃度復合肥的大量使用，不僅使得土壤中磷素過剩，利用率低，還導致了一系列的環境污染問題。小麥、玉米、水稻等大眾農作物根際土壤和植株體內的溶磷菌已被廣泛篩選和開發利用，溶磷機理也逐步得到闡明[16]，極大地促進了這些農產品的“綠色生產”，而對于糜子內生菌的開發利用目前尚無研究報道。本試驗從產自寧夏回族自治區和甘肅省的糜子種子中分離、篩選出具有高效溶磷能力的菌株，通過盆栽試驗研究了這些溶磷真菌對糜子苗期生長發育的影響及其解磷效果，以期為糜子的“綠色生產”和高效栽培提供技術依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

選用產自寧夏回族自治區(固糜21號、寧糜11號、寧糜14號)和甘肅省(隴糜9號、隴糜13號、隴糜14號)兩地不同品種健康飽滿的糜子種子，于2018年10月采集后裝于自封袋中，在實驗室中4 ℃保存，用于進行快速的分離培養。供試培養基包括：PDA培養基(馬鈴薯200 g,葡糖糖20 g，瓊脂15 g，自來水1 000 ml自然pH值)；NBRIP培養基：葡萄糖10 g，Ca3(PO4)25 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，MgCl2·6H2O 5 g，KCl 0.2 g，(NH4)2SO40.1 g,蒸餾水1 000 ml，瓊脂16 g，pH值6.5～7.5，液體培養基不加瓊脂。營養瓊脂培養基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g,瓊脂17 g,蒸餾水1 000 ml，pH值為7.2。

1.2 方 法

1.2.1 溶磷真菌的分離 將采自寧夏(固糜21號、寧糜11號、寧糜14號)，甘肅(隴糜9號、隴糜13號、隴糜14號)不同品種健康飽滿的糜子種子在自來水下洗凈后轉移至超凈臺。消毒方法參考López-López等[17]的消毒方式并稍加改進。第一輪消毒，1 g種子首先用40 ml自來水沖洗3次，然后用40 ml蒸餾水沖洗3次。清洗后的種子用40 ml 3.5%次氯酸鈉溶液浸泡5 min，然后用50 ml無菌蒸餾水洗滌3次。第2輪消毒，將種子浸泡在40 ml 96%乙醇中5 min，然后用50 ml無菌蒸餾水進行5次徹底清洗。檢查表面消毒，將100 μl最終沖洗水在營養瓊脂平板培養，在28 ℃下培養4 d，若無任何細菌真菌生長，則表明消毒完成。將表面消毒滅菌后的糜子種子分別接入PDA培養基(規格：90 mm一次性培養皿)，每個PDA培養皿中均勻放置3粒種子，5次重復。在恒溫培養箱中培養7～12 d，溫度設置為25 ℃，通過觀察菌落形態的差異并進行純化，直至得到單一的純菌落。菌落編號后用斜面PDA保存于4 ℃冰箱中備用。

1.2.2 溶磷真菌的篩選 將上述分離純化得到的菌株分別接種于NBRIP固體平板培養基上，26 ℃恒溫培養箱培養20 d，測定菌落直徑(d)和溶磷圈直徑(D)，并計算D/d，對得到的菌株進行初步篩選。將初步篩選得到的具有溶磷作用的菌株接種于PDA培養基，恒溫培養箱26 ℃擴繁培養10 d；將擴繁后的菌株在超凈工作臺進行無菌操作，取5個直徑5 mm的菌塊接種至盛有50 ml滅菌NBRIP液體培養基的錐形瓶中(錐形瓶規格：150 ml)，以接種無菌PDA培養基塊為對照(CK)，每個菌株3個重復，恒溫振蕩儀振蕩培養7 d(27 ℃，120 r/min)，振蕩完畢后用定性濾紙過濾，用pH計測定pH值并采用鉬銻抗比色法測上清液有效磷含量，用UV-1800紫外可見分光光度計在880 nm處測定OD值，計算上清液有效磷含量的溶磷率，結合溶磷圈大小確定不同菌株對無機磷的溶解能力。

溶磷率=〔(接菌培養基中可溶性磷含量—接培養基的對照組中的可溶性磷含量)/加入的無機磷源的總磷量〕×100%

1.2.3 盆栽試驗 將篩選后的溶磷內生菌打碎孢子團，加無菌水制作菌懸液，菌懸液分生孢子濃度1.0×106個/ml，將滅菌后的固糜21號種子，在菌懸液中浸泡24 h后播種，試驗采用石英砂+蛭石(體積比2∶1)的混合滅菌基質每盆1.55 kg，將磷酸三鈣以6 g/kg混合施入基質(模擬土壤中的無機磷成分)，裝入規格為內徑18.5 cm，外徑21 cm，高11.5 cm，底徑14 cm的塑料花盆內。試驗對5種供試溶磷真菌菌液和不加菌液的無菌水(對照)分別設置4磷素梯度即施加無P,1/5 P,1/2 P,全P Hoagland滅菌營養液(見表1)，共24個處理，每處理3重復，共72盆。將浸泡后的固糜21號種子進行播種，每盆澆灌稀釋1/2后的全P滅菌Hoagland營養液500 ml后覆膜，出苗一周后去掉薄膜選擇長勢相近的植株間苗(每盆保留10株)并進行磷素控制，各磷素梯度每10 d澆灌滅菌Hoagland營養液500 ml，各菌懸液500 ml。試驗將于2019年5月10日于中國科學院固原生態試驗站旱棚內進行，于2019年6月20日收獲。

表1 不同磷素(P)梯度Hoagland營養液

1.2.4 測試指標 于2019年6月20日用葉綠素測定儀LYS-A型測試糜子SPAD值，用LI-6800便攜式光合儀測試糜子凈光合速率。采集糜子植株測其株高、鮮重，105 ℃下殺青30 min，75 ℃烘干至恒重后測定干重。將植株干樣粉碎后用H2SO4-H2O2消煮，鉬黃比色法測定植株全磷含量。

1.2.5 溶磷內生真菌的鑒定 利用通用引物ITS1/ITS4(ITS1：5‘-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，ITS4：5‘-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)對溶磷內生菌菌株核糖體基因轉錄間隔區進行擴增。PCR體系為：Premix TaqTM 15 μl(Takara Biotechnology Co.,Ltd.,Dalian,China No.RR003A),DNA 2 μl，ITS1引物1 μl，ITS4引物1 μl，ddH2O 11 μl。PCR循環條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，40次循環，72 ℃延伸10 min。取3 μl PCR擴增產物，在混有0.01%EB核酸染劑的1%瓊脂糖凝膠上進行電泳，紫外凝膠成像儀下進行檢測。PCR擴增產物純化后送上海生工生物技術有限公司測序。將測序所得結果通過Chromas軟件進行校訂，校訂后的序列提交GenBank數據庫，并在NCBI的GenBank數據庫中用Blast程序與數據庫中的序列進行比對，尋找匹配度最高的生物序列進行溶磷內生真菌的鑒定。初步確定溶磷內生菌的分類學地位。對溶磷效果明顯的菌株，下載同源序列，用Clastw比對后，采用MEGA 6.0軟件構建NJ系統樹，拓撲樹檢驗重復1 000次。

1.2.6 數據處理 運用Excel和IBM SPSS Statistics 20.0軟件進行數據處理和統計分析，LSD法進行多重比較，判斷差異顯著性;采用Origin 2016軟件繪圖，MEGA 6.0軟件構建系統樹。

2 結果與分析

2.1 溶磷真菌的初步篩選

溶磷圈指的是在溶磷微生物的作用下，將無機磷固體培養基中的難溶性磷酸鹽溶解，在菌落周圍形成的透明地帶，一般將溶磷圈直徑(D)與菌落直徑(d)的比值(D/d)視為初步篩選溶磷菌株能力大小的指標之一。D/d值越大，其溶磷能力也就越強[18-19]。從寧夏、甘肅當地糜子種子內分離的內生真菌中，固糜21號分離得到4株，寧糜11號5株，寧糜14號4株，隴糜9號3株，隴糜13號3株，隴糜14號6株。在以磷酸三鈣為唯一磷源的固體培養基中能產生溶磷圈的菌株有5株。其中2株來自甘肅省，編號為LM1和LM2；3株來自寧夏，編號為GM1，GM2，GM3。在連續觀察5株菌株20 d內發現，5株菌株生長至16 d時，D/d值基本趨于穩定，整體表現為：GM1>GM3>LM1>LM2>GM2，其中GM1，GM3號菌株D/d值達到了1.59和1.47，初步判斷這兩株菌株溶磷能力強于其他菌株(見圖1)。

注：LM1，LM2分別代表來自甘肅省糜子品種的2株菌株；GM1，GM2，GM3分別代表來自寧夏回族自治區糜子品種的3株菌株。下同。

2.2 溶磷真菌的復篩及溶磷能力的比較

將5株可溶性溶磷真菌在NBRIP液體培養基中培養，并測定其培養液中的可溶性磷含量及pH值(見表2)。5株溶磷內生真菌對Ca3(PO4)的溶解能力很強，各菌株培養液中的可溶性磷含量及溶磷率均顯著(p<0.05)高于空白對照，各菌株可溶性磷含量在164.88～323.48 μg/ml，溶磷率范圍在3.26%～6.43%。其中，GM3號菌株的溶磷效果最好，顯著(p<0.05)高于其他菌株，溶磷率為6.43%，可溶性磷含量達到了323.48 μg/ml。GM1，GM2，LM1，LM2依次次之，溶磷率分別達到了5.26%，4.36%，3.56%和3.26%，可溶性磷含量分別為264.75，219.65，180.03，164.88 μg/ml。這與初步篩選得到的結果基本一致，進一步確定GM3，GM1號菌株溶磷能力較強。

表2 溶磷真菌對Ca3(PO4)2的溶解能力

從培養液中的pH值看，各處理均顯著(p<0.05)低于對照，其中GM1，GM3號菌株培養液的pH值最低，分別為2.88，3.63。LM1，LM2，GM2號菌株的培養液pH值在4.1～4.4。從溶磷率與pH值的變化趨勢來看，隨著溶磷率的提高，pH值大致呈下降的趨勢。相關性分析表明，5株溶磷真菌溶磷率(X)與其pH值(Y)呈極顯著負相關(r=-0.899**，p<0.001)，線性回歸方程為：

Y=-0.678X+7.093

2.3 接種溶磷真菌對糜子苗期生理特征及植株全磷的影響

2.3.1 接種溶磷真菌對糜子苗期生長的影響 在不施P的情況下，GM3號處理下的糜子干重較對照增加178%(見表3)。在施1/5 P及常量施P時，不同菌株對糜子的苗期株高、鮮重、干重的影響不明顯。在施1/2 P時，GM3，GM1號菌株均能夠顯著(p<0.05)增加糜子苗期株高和鮮重，株高較對照分別增加了24.9%和26.5%，鮮重較對照分別增加了44.52%，42.89%。

表3 不同磷素梯度下溶磷真菌對糜子苗期生長的影響

從5株溶磷真菌在4種不同磷素梯度下對糜子苗期株高、鮮重、干重的影響來看，GM1，GM3號菌株較于其他菌株對糜子苗期的生長促進作用更大，而且在磷素梯度為1/2 P時對糜子株高、鮮重、干重的增加更加明顯。

2.3.2 溶磷真菌對糜子苗期葉綠素的影響 SPAD值是衡量植物葉綠素相對含量的一個參數。由圖2可知，不施P時，各處理間糜子的SPAD值在16.97～19.21。常量施P時，各處理間糜子的SPAD值在18.88～21.29。在這兩種磷素梯度下，各菌株處理下的SPAD值較對照雖有變化，但差異并不明顯。施1/5 P時，GM3，GM2號菌株處理下的糜子SPAD值顯著(p<0.05)高于對照，達到了20.63和20.3，較對照分別提高20.67%和18.71%。施1/2 P時，GM3，GM1號菌株處理下的糜子SPAD值為21.46和21.6，與對照相比，增加22.28%，23.07%。整體來看，在不施P及常量施P的情況下，各菌株對糜子SPAD值的影響并不大。在施P為1/5，1/2時，GM3號菌株均能顯著增加糜子SPAD值。

2.3.3 溶磷真菌對糜子苗期凈光合速率的影響 如圖3所示，不施P時，GM1，GM2，GM3號菌株處理下的糜子凈光合速率較對照分別提高45.12%，48.92%和52.2%。施1/5 P時，GM3號菌株處理下的糜子凈光合速率顯著(p<0.05)高于其他處理，達到了23.2 μmol/(m2·s)，較對照提高145.76%，同時，LM1，GM1，GM2處理下的糜子凈光合速率均顯著(p<0.05)高于對照，分別提高48.47%，74.58%，69.49%。施1/2 P時，GM3號菌株處理下的糜子凈光合速率為25.87 μmol/(m2·s)，顯著(p<0.05)高于其他處理，與對照相比提高104.18%，同時，LM1，GM1，GM2處理下的糜子凈光合速率均顯著(p<0.05)高于對照，分別提高40.34%，60.22%，55.25%。常量施P時，GM3號菌株處理下的糜子凈光合速率為25.47 μmol/(m2·s)，顯著(p<0.05)高于對照，較對照提高61.71%。整體看來，在不同磷素梯度下，各菌株處理下的糜子苗期凈光合速率與對照相比有明顯差異，GM3號菌株在4種磷素梯度下均能顯著增加糜子凈光合速率且增幅最大。

2.3.4 溶磷真菌對糜子植株苗期全磷的影響 由圖4可以看出，不施P時，GM3號菌株能夠顯著(p<0.05)增加糜子植株全磷含量，為8.87 mg，較對照增加290.74%。施1/5 P時，與對照相比，GM3號菌株處理下的糜子植株全磷顯著(p<0.05)增加了168.35%，含量達到了10.09 mg/盆。施1/2 P時，GM3號菌株處理下的糜子植株全磷含量為12.39 mg/盆，較對照顯著提高121.25%。常量施P時，各處理下的糜子植株全磷與對照相比無顯著差異。在缺磷或少磷情況下，GM3號菌株均能顯著提高糜子植株全磷含量。

注：不同字母表示不同處理間差異達0.05顯著水平，未標注則差異不顯著。下同。

圖3 溶磷真菌對糜子苗期凈光合速率的影響

圖4 溶磷真菌對糜子植株苗期全磷的影響

2.4 溶磷真菌的初步鑒定

采用CTAB法分別提取5株溶磷真菌的DNA，并利通用引物ITS1/ITS4對5株溶磷真菌菌株核糖體基因轉錄間隔區進行擴增。PCR擴增產物純化后送上海生工生物技術有限公司雙向測序。

將測序所得結果通過Chromas軟件進行校訂后，將5株溶磷內生真菌的18 SrDNA ITS區序列分別與GenBank中的菌株序列進行相似性分析進行初步鑒定(結果見表4)。

由表4可見，LM1，LM2，GM1為黃絲曲霉屬(Talaromycessp.)，GM2，GM3為青霉屬(Penicilliumsp.)，初步確定了5株溶磷內生菌的分類學地位。從以上5種溶磷內生真菌在盆栽試驗的綜合表現來看，菌株GM3號表現最為優異，為本試驗得到的促生潛力菌株。

表4 溶磷內生真菌初步鑒定結果

GM3的ITS rDNA經PCR擴增后，擴增產物長度為500～520 bp。從NCBI數據中下載GM3的同源序列，用Clastw比對后，采用MEGA 6.0軟件使用臨近(NJ)法對GM3菌株及所下載相似度較高菌種的ITS序列構建系統發育樹(見圖5)，鑒定菌株GM3為產黃青霉(Penicilliumchrysogenum)，GenBank序列登記號為MT229079，系統發育樹按一定比例繪制，分支長度用于推斷系統發育樹的進化距離。

圖5 產黃青霉GM3菌株的系統發育樹

3 討 論

通過溶磷圈直徑、菌落直徑及二者比值只能直觀定的表示溶磷真菌的溶磷能力，只通過這種方式來判斷溶磷能力大小并不準確和可靠[20-21]，若想進一步確定溶磷能力的強弱還需要定量的測定培養液中的可溶性磷含量。如圖1可以看出，GM1，GM3號菌株D/d值達到了1.59和1.47，而在表2中GM1，GM3號菌株可溶性磷含量分別為264.75，323.48 μg/ml,兩種方法得到的結果有差異，這可能是由于不同菌株對環境的適應性不同所致。

溶磷真菌類主要有青霉菌(Penicillium)、曲霉菌(Asperillus)、根霉(Rhizopus)、鐮刀菌(Fu-sarium)、小菌核菌(Selerotium)等[22]。本研究從糜子種子內得到的5株溶磷真菌，其中：LM1，LM2，GM1為黃絲曲霉屬(Talaromycessp.)，GM2，GM3為青霉屬(Penicilliumsp.)。其中溶磷效果較好的GM3號菌株經系統鑒定為產黃青霉(Penicilliumchrysogenum)。溶磷微生物溶磷過程非常復雜，存在多種機理，主要機制包括質子的釋放、有機酸的產生和酸性磷酸酶的生物合成作用[23-24]。微生物分泌有機酸機制是人們目前廣泛接受的學術理論[25]。越來越多的研究表明，溶磷量與培養液中的pH值存在一定的負相關性[22,26]。在本試驗中，從溶磷真菌復篩的結果中可以看出，各菌株培養液中的pH值均顯著低于對照并且隨著溶磷率的提高，pH值大致呈下降的趨勢。經相關性分析5株溶磷真菌的溶磷率與培養液中的pH值呈極顯著負相關，這與徐冰等[27]、劉輝等[28]的研究結果基本一致。

在植物根系接種溶磷真菌不僅可以提高植物吸收磷素，轉化難溶性磷為有效磷[9],還能夠增強葉片的光合作用，提高植物的碳素營養，促進植物生長，增加植物的生物量或干重[29]。

在本次的盆栽試驗中，供試的5個曲霉科菌株都對苗高、鮮重、葉綠素含量、光合速率、植株磷素累積有促進作用，其中GM3效果較好。

在不施P的情況下，GM3號處理下的糜子干重較對照顯著增加178%。施1/2 P時，GM3號菌株能夠顯著(p<0.05)增加糜子苗期株高和鮮重，株高較對照增加24.9%，鮮重較對照增加44.52%。葉綠素是植物進行光合作用的主要色素并且在光合作用的光吸收中起核心作用，而凈光合速率指的是植物光合作用積累的有機物，很大程度上能反映出植物的營養狀況和健康程度[30]。施1/5 P和1/2 P時，GM3號菌株處理下的糜子SPAD值分別達到了20.63，21.46，凈光合速率分別達到了23.2和25.87 μmol/(m2·s)且顯著(p<0.05)高于對照。磷不但是植物體中許多重要化合物的成分，而且以多種方式參與植物的新陳代謝[1]。在缺P，1/5 P及1/2 P情況下，GM3號菌株較對照分別增加了290.74%，168.35%，121.25%的植株全磷含量，這表明在缺磷或者少磷的情況下GM3號菌株均能有效增加糜子的磷素累積。溶磷真菌將難溶的磷酸三鈣中的磷釋放出來，一部分供真菌自身生長繁殖所需在菌體中積累起來，另一部分可被植物吸收利用[31]。在常量施P情況下，磷素對于苗期糜子的生長發育已經足夠，溶磷菌株的作用可能很大程度被減弱甚至掩蔽。盆栽試驗中雖然驗證了溶磷真菌對糜子生理特征的影響，但其機理性仍需進一步的研究。

曲霉科真菌是Class 1型內生真菌，可通過種子進行垂直傳播，對糜子適應干旱和半干旱環境具有重要的作用[32]。青霉和曲霉是沙漠植物常見的內生真菌，他們的菌絲含有明顯的色素，又稱為色素真菌[33-34]，這些色素可以幫助植物吸收紫外線，提高植物耐高溫和干旱的能力。本研究在分離的糜子中，20%的種子發現有這些真菌，他們在糜子適應性、產量和品質方面的作用尚需要進一步研究。

4 結 論

從寧夏、甘肅不同糜子品種內共分離得到25株內生真菌，其中的5個內生菌株屬曲霉科真菌，它們具有一定的溶磷能力，經初步鑒定后發現LM1，LM2，GM1為黃絲曲霉屬(Talaromycessp.)，GM2，GM3為青霉屬(Penicilliumsp.)，其中GM3經鑒定為產黃青霉(Penicilliumchrysogenum)。GM1，GM3號菌株為溶磷能力較強的菌株，可溶性磷含量分別為264.75和323.48 μg/ml，溶磷率分別高達5.26%和6.43%。5株溶磷真菌的溶磷率與pH呈極顯著負相關(r=-0.899**，p<0.001)，這表明溶磷菌的溶磷能力可能與其分泌的酸有關。在1/5 P和1/2 P處理下，GM3產黃青霉(Penicilliumchrysogenum)處理下的糜子SPAD值分別為20.63和21.46，較對照提高20.67%,22.28%；凈光合速率分別達為23.2和25.87 μmol(m2·s)，較對照提高145.76%,104.18%；植株全磷含量分別為10.09和12.39 mg/盆，較對照提高168.35%,121.25%，均顯著高于對照。表明GM3對糜子促生作用明顯，表現出了良好的溶磷效果,研究結果為旱地糜子生產實現“減肥減藥”提供了一個新的技術途徑。