巖石-土壤-四川牡丹元素遷移體系中的微生物效應

馮瑋娜，彭培好，謝成晟，羅 雯

(成都理工大學 地球科學學院,四川 成都 610059)

土壤是地球關鍵帶的重要組成部分，生物和非生物在此進行著高頻率的物質交換和能量、信息的傳遞[1-2]。土壤對成土母巖有一定的物質繼承性，土壤中大約80%～100%的鉀、鈣、鎂和磷來自巖石的風化輸入[3]。成土母巖是植物礦質元素的初始來源，成土初期，巖體微裂隙及表面附著的微生物和低等植物在營養需求的驅動下直接與巖石作用，在促進巖石風化釋放礦質元素的同時固定碳，為植物的生長儲備條件；土壤中的動植物及微生物生活產生的酸性和具有生命活性的分泌物促進巖石礦物的進一步風化[2-3]。快速的風化并不等于可利用元素的快速補充，早期風化產物難以發生化學變化，而微生物快速多樣的代謝過程所塑造的氧化還原微環境則為元素形態轉化、次生礦物的進一步風化提供了動能[4-5]。土壤微生物的結構和功能深刻影響著全球元素(主要是碳氮)大循環和巖石—土壤—植物間的元素小循環[6-7]。然而，由于微生物種類繁多、功能多樣、微生物群落間、微生物與其它生物和非生物關系復雜，其在土壤中所承擔的生態功能至今未得到清晰的描述[8]。

巖石風化與元素循環直接影響土壤營養結構，從而進一步影響植物生長和生態演化[9-11]。例如，中國干旱及半干旱區，土壤元素平衡(P，S，Be，Al，Mo，Pb，Cd，Ni)對禾本科、莎草科、豆科植物的生長有重要影響。中國干旱區，磷是控制草甸草原發展的關鍵因素之一[12]。四川牡丹是一種自然分布帶狹窄的極小種群[13]，多生長于營養貧瘠的坡積物上，其獨特的基質條件和營養循環特點尚未得到深入研究。本文就四川牡丹生境的巖土元素組成特點進行研究，并描述幾種大量、微量營養元素的遷移富集規律，分析細菌、真菌在元素遷移吸收過程中的效應，為了解營養元素的表生地球化學行為規律、微生物在元素遷移體系中的作用提供理論依據，同時為研究四川牡丹及其它干旱河谷地帶性植被的基質條件與營養循環提供參考數據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

四川牡丹生長于岷江及大渡河上游海拔2 204～2 800 m的干旱河谷地帶，谷坡多在30°～40°之間，有的甚至更高。土壤層薄、石礫多、成熟度低。根據四川牡丹野外分布調查結果，于2018和2019年8月下旬在四川牡丹的5個集中分布區(見表1)，分別選擇3～5個四川牡丹分布較集中的地點劃分5 m×5 m的樣方。每個樣方內隨機選擇3株四川牡丹，于地莖30 cm范圍內根系分布密集處采集土壤，混合為1份土壤樣品。四川牡丹生長的土壤層極薄，故在除去土壤表層枯落物后垂直挖取土壤截面至礫石層，不分層取樣。同時使用經75%酒精消毒的鐵鏟、無菌手套等取樣工具，取根莖抖落土壤于無菌密封袋中，并立即使用冰袋保存送回實驗室。收集樣方內所有植株已成熟的種子。對照區域地質圖在四川牡丹垂直分布帶的上、中、下部各尋找一處母巖出露處采集母巖樣品。共取得35件土壤樣品(包括12件根際土壤樣品)，17件巖石樣品以及25件植物種子樣品。

表1 研究區樣點布置

1.2 元素含量測定

取巖石、自然風干后的土壤粉碎并過75 μm 200篩目篩，經105 ℃烘干2 h后使用硝酸、氫氟酸3∶2微波消解[14]。

植物種子先后于烘箱105 ℃烘干30 min，80 ℃烘干4 h，過60目篩，采用硝酸、雙氧水8∶2濕法消解。所有消解后的樣品經過濾，ICP-OES測定P，S，K，Na，Ca，Mg，Al，Fe，Mn，Cu的含量(巖石、土壤中的元素含量以氧化物計)[14]。取自然風干，過60目篩的土壤電位法[15]測定土壤pH值。

1.3 微生物基因測序

使用ZymoBIOMICSTM DNA Minipre Kit提取試劑盒提取根際土壤的細菌和真菌DNA，經PCR擴增及檢測(擴增引物詳見表2)，產物回收后，使用TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep Kit所建文庫，于Illumina Hiseq 2500平臺PE250模式測序。測序結果經過Trimmomatic2976質控及除雜，在97%的一致性水平上進行OTU聚類及分類注釋[16]。

表2 土壤細菌及真菌PCR擴增引物序列[17-18]

2 數據處理

元素遷移累積系數=(X土壤/Al土壤)/(X巖石/Al巖石)，表征某元素(X)相對于參比元素Al的遷移積累特征。植物吸收富集系數=(X植物/X土壤)×100%，表征元素從土壤到植物的生物吸收特征。土壤風化淋溶率以土壤、巖石的風化淋溶指數之比表示，指數包括：鋁鐵系數(Af)=Al2O3/Fe2O3，堿金屬淋溶系數(Kn)=(Na2O+K2O)/Al2O3，堿土金屬淋溶系數(Cm)=(CaO+MgO)/Al2O3和鋁化率(α)=Al土壤/Al母巖[19]。微生物物種多樣性(Alpha)指數包括豐富度指數ACE和Chao1，多樣性指數Shannon，Simpson(此處以1-Simpson指數的值計)和InvSimpson[16,20]。

使用Canoco 5默認程序進行主成分分析和冗余分析，SPSS 25進行因子分析和Person相關性分析，R 3.6.1的corr.test函數對元素含量和微生物豐度進行Spearmen相關分析(p<0.05)，并基于相關性結果使用igraph程序包構建網絡圖。

3 結果與分析

3.1 元素遷移富集特征

與華東地臺沉積蓋層相比，四川牡丹生長區母巖的Cu，S含量豐富，Ca，Mg含量較低(表3)。K，Ca，Na的最大值與最小值均相差四倍以上，反映各樣地母巖的鹽基儲量差異較大。四川牡丹生長土壤pH值介于7.4～8.0之間(表中未列出)，呈弱堿性。與全國表層土壤相比，四川牡丹生長土壤中S，Ca，Cu含量偏高，尤其是Ca遠超過全國表層土壤鈣含量的95%區間。S，Cu在各樣點間含量差異較大，其最大值與最小值之比分別為4.89，3.24。植物種子中Al，Fe含量差異較大，最大值與最小值之比分別為3.08，3.45。

表3 研究區巖石、土壤、植物元素含量

土壤營養元素的遷移富集系數排序為：Ca>Na>S>P>Mg>K>Al>Fe>Mn>Cu。其中P，S，K，Ca，Na，Mg的遷移富集系數大于1，在土壤中相對富集，Fe，Mn，Cu的遷移富集系數小于1，表示其相對于Al發生了淋失。四川牡丹種子的元素吸收系數排序為：P>S>K>Cu>Mg>Ca>Na>Mn>Fe>Al。其中P，S的富集系數大于100%，表示其在四川牡丹種子中相對于土壤富集(見表3)。Al，Fe均是植物所需的微量元素，其吸收率均不到1%。

3.2 元素組合特征

成土過程中諸多因素的干擾使得相互影響的元素之間往往難以呈現出線性關系，通過主成分分析探討元素間的潛在關聯有助于理解成土過程中的元素行為規律[23]。母巖與土壤之間的元素組成差異由主成分1解釋，各樣地之間的元素組成差異由主成分2解釋(見圖1)。因子向量向主軸的投影為因子貢獻率。相對于母巖，土壤以高Al2O3，CaO含量和低Cu，Na2O含量為最主要特征。這與元素遷移富集順序稍有偏差，因為主成分分析更關注樣點間的總體組成差異。巖石在各樣點間的組成差異由主成分2解釋，K2O，Na2O，Fe2O3是最主要的載荷因子，表明3者含量不同是母巖元素組成的主要差異。相較于母巖，各樣點土壤的組成較為相似，這符合均一化理論，同時表明5個樣點的成土過程基本相似。

因子1和因子2分別指示母巖中大量元素(氧化物)和微量元素(見圖1)。主要存在兩個元素組合：①因子1的主要正載荷因子為Al2O3，Fe2O3，S，K2O，P，CaO；②因子2的主要正載荷因子為Mn，Cu。

土壤中存在兩個組合：①因子1的主要正載荷因子P，S，Mn，Cu；②一二象限的Fe2O3，K2O，CaO，MgO，Al2O3(見圖1)。對比圖1中的各元素組成特征可知，母巖與土壤的元素(氧化物)組合基本相似，反映土壤對母巖的物質繼承性。不同之處在于土壤的P，S移入了Mn，Cu的組合中(其中P與Mn相關性顯著，圖3)，表明兩種元素在母巖和土壤中的主要存在形式可能不同。

此外，pH值與K2O，CaO同是因子1的主要負載荷因子，表明土壤酸堿度與土壤K，Ca的遷移積累可能存在相互影響(見圖1)。因子1指示基質的營養限制，其主要正載荷因子Al，Mn，P(其中Al分別與Mn，P顯著相關)在種子中的含量均受到巖石和土壤元素組成的影響；因子2的正載荷因子S，Fe，Mg，Cu均受到微生物活動的影響，其中S，Mg，Fe兩兩之間顯著相關。Fe和Mg無論是在巖石、土壤還是植物中均在一個組合內，雖然兩者沒有顯著的相關關系，但仍可以推測兩者在遷移吸收過程中存在潛在相互影響。

圖1 巖石、土壤、植物種子的元素組成特征

3.3 土壤環境與微生物多樣性

鋁鐵率、堿金屬和堿土金屬淋溶率越小，鋁化系數越高表明土壤經歷的風化淋溶程度越強，成熟度越高。鈣的高度聚集(見表3)使得堿土金屬淋溶率在此處并不適宜作為衡量土壤風化程度的指標，因此，堿土金屬淋溶率僅作為衡量CaO，MgO相對淋溶或富集情況的度量。堿金屬淋溶率在0.3～1之間，鋁化系數和鋁鐵率多在0.8～2之間，總體表現為土壤淋溶程度較弱(見表4)。

表4 研究四川牡丹生長區的土壤風化淋溶率均值

對細菌群落Alpha多樣性和土壤風化淋溶率做冗余分析。前兩個主軸共解釋了總變量的74.68%(見圖2)。4種風化率指數所指示的風化程度與微生物多樣性之間的關系并不一致，表明四川牡丹生長土壤的風化進程并不是控制根際土壤微生物群落的主要因素。但是，堿土金屬淋溶率(Cm∶F=4.7，p=0.036)和鋁鐵率(Af∶F=3.0，p=0.04)兩個解釋變量仍然可以很好地解釋細菌的多樣性。堿土金屬淋溶率與細菌多樣性指數(Shannon，Simpson和InvSimpson)呈正相關，與物種豐富度指數(ACE，Chao1)呈負相關，Af則正好相反。這表明隨著土壤Ca，Mg，Fe相對積累程度加深，細菌多樣性增加而豐富度反而有降低的趨勢。所有指標均無法解釋真菌的Alpha多樣性，表明四川牡丹根際真菌對土壤環境變化的響應不如細菌敏感。

圖2 土壤風化淋溶率與細菌多樣性冗余分析

堿土金屬淋溶率與細菌的擬桿菌門(Bacteroidetes)、Epsilonbacteraeota呈高度正相關，與硝化螺旋菌門(Nitrospirae)呈負相關，這三類細菌多具有與硝化相關的代謝途徑(見表5)。鋁鐵率與真菌的座囊菌綱(Dothideomycetes)相關性顯著，鋁化系數與盤菌綱(Pezizomycetes)和傘菌綱(Agaricomycetes)相關性顯著。上述菌類均是根際土壤中的優勢菌種[16]。

表5 土壤風化淋溶率與微生物相關性

3.4 網絡分析

網絡圖便于反映微生物之間、元素之間、微生物與元素之間直接或間接的相關關系。模塊1與微生物均無顯著相關性，這部分主要包括巖石元素，以及土壤的P，Mn和植物的P，Al，Mn(圖3)。說明P，Mn在巖石—土壤—四川牡丹種子的遷移體系中可能主要受控于母巖。微生物主要影響模塊2，3，其中包括土壤元素：K，Ca，Mg，Al，Fe和種子元素：K，Na，Ca，Mg，Fe，S。此外，土壤S、植物Cu以及巖石Cu，Mn，Mg，P，S的含量同樣與部分微生物的豐度顯著相關。巖石和土壤微生物可通過土壤的橋梁作用產生相互影響，而這一過程如何發生在網絡圖中并未體現。

對比可知，Epsilonbacteraeota將巖石的Mn元素連接進入模塊2中，細菌類的疣微菌門(Verrucomicrobia)、厚壁菌門(Firmicutes)、Latescibacteria和真菌類的糞殼菌綱(Sordariomycetes)、錘舌菌綱(Leotiomycetes)、盤菌綱(Pezizomycetes)、古菌根菌綱(Archaeorhizomycetes)作為一個整體將土壤Ca和植物Mg連接到模塊2中，變形菌門(Proteobacteria)、螺旋體門(Spirochaetes)和座囊菌綱(Dothideomycetes)將模塊3中的元素連接成為一個整體。上述微生物作為連接多種元素的節點，在營養反饋與調節上可能具有重要意義。微生物的加入使整個網絡趨于復雜，它們不僅為元素間的反應提供了更多的途徑還改變了元素之間的關系。細菌和真菌之間沒有明顯的分區，表明其在元素循環中的主要功能相似。

4 討 論

(1) 四川牡丹的基質條件。四川牡丹生長土壤以弱堿積鈣為主要特征。母巖鈣含量低，不足以形成高鈣土壤。其分布區少雨干燥的氣候特點(年干燥度約1.6～2.5)或為土壤鈣化提供條件[13]。除Ca在土壤中發生大量積聚外，K，Na，Mg相對于Al均發生輕微的富集。一方面，四川牡丹生長區受焚風效應影響，在高水分蒸發狀態下，鹽分可隨著土壤毛細管道上移并在表土層積聚，這一現象易發生在干旱、半干旱及半濕潤區[24]。另一方面，土壤中的鹽基組分可能存在外源輸入。四川牡丹生長區屬于青藏高原東南緣，構造抬升導致山體破碎，河谷谷坡陡峭，水土流失嚴重，初期風化產物在重力及流水作用下堆積于谷坡凹陷或坡度減緩處發育成壤是植被發展的基礎[25]，谷坡上部土體及巖體經風化淋失的元素同樣易在此匯集沉淀[26]，最終可在植被、氣候等作用下形成鹽基組分的富集。相比于一般的植物吸收順序，Cu較之Ca，Mg，Na位置較靠前，但4者含量均在正常范圍內。

a 巖石—土壤—四川牡丹種子元素網絡圖 b 微生物與元素網絡圖

(2) 元素組合特點。P和S是表生系統中較為活躍的元素，兩者組合關系的變化可能與其賦存形式、元素遷移動力等因素有關。巖石中的S與Ca，K，Al，Fe在同一組合內且相關性顯著(圖3)，表明S可能主要以硫酸鹽、硫鐵化合物等形式存在于巖石中，而土壤中的S可能主要以Cu或Mn的硫化物形式存在(見圖1)。堿性土壤中的P多以Ca-P的形式存在[25]，但P與Mn的相關性說明土壤中可能有相當一部分P以Mn-P形式存在[27]。四川牡丹生長土壤常以坡積物為成土母質，土壤成熟度低，因此土壤元素組成得以保留其母巖的主要特征，其主要造巖元素組合關系未發生變化，這一特征在干旱、半干旱區等風化程度弱的區域較為常見[28]。

(3) 土壤環境與微生物多樣性。一般而言，土壤微生物的多樣性和豐富度隨著土壤風化程度的加深而趨于增加[29]。這一點并未在四川牡丹的根際土壤微生物中體現，其原因可能在于微生物群落中普遍存在的結構冗余，即多個群落單元共同行使同一項功能的現象，使得微生物對環境變化有一定的承載能力，微小的環境變化與群落結構間往往沒有確定關系[30]。但是，Ca，Mg，Fe的相對積累程度仍然是控制細菌多樣性的主要因素之一。鈣鎂可通過改變微生物代謝活性及途徑影響微生物群落結構。Rosenberg和Balland[31-32]通過控制試驗證明鈣鎂可直接影響土壤微生物的生物量、活性，以及改變微生物的礦物風化能力。鐵對微生物來說是理想的電子傳遞載體，微生物與Fe的反應控制著有機物礦化、反硝化等關鍵性土壤元素循環過程[33]。元素遷移對微生物的影響并非單向作用，如土壤中鈣鎂含量的變化可影響細菌從云母中提取鐵的能力[32]，進而推動多種元素的遷移。

(4) 微生物與元素遷移。本文以網絡模塊為單元分析微生物在元素遷移體系中的作用，模塊2是整個網絡的核心，幾乎所有元素都與某類微生物或微生物群存在直接或間接的相關關系(見圖3)。其中Ca，Mg，Fe，S是微生物鏈接進入該網絡的主要節點，亦是微生物作用的主要對象。上述元素的相互作用間接影響著包括Mn，Al，K，Cu在內的諸多元素的活動。所有關鍵節點的真菌均屬于子囊菌門，其中包括多種菌根和地衣，被認為是陸地植被進化的關鍵[34]。細菌中的厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)和變形菌門(Proteobacteria)廣泛寄生于巖石中，對巖石的風化和土壤的初始形成有著重要作用[35]。其中以典型的鐵氧化細菌——變形菌門(Proteobacteria)的希瓦氏菌(Shewanella)的研究最為廣泛[2]。由于缺少諸如植物、流水、氣候、地形等關鍵性因子，微生物與元素是如何發生相互作用的我們并未得知。

5 結 論

(1) 四川牡丹生長土壤以弱堿富鈣為主要特征。元素遷移富集系數排序為：Ca>Na>S>P>Mg>K>Al>Fe>Mn>Cu；吸收系數排序為：P>S>K>Cu>Mg>Ca>Na>Mn>Fe>Al。

(2) 母巖元素組成特征在土壤中基本得以保留，P和S在成土過程中較為活躍。

(3) Ca，Mg，Fe的相對淋溶或相對積累程度是四川牡丹根際土壤細菌多樣性的主要控制因素之一。

(4) P和Mn在巖石—土壤—四川牡丹種子中的遷移主要受巖石組分控制。細菌和真菌在元素遷移體系中的作用相似，主要參與Fe，S，Mg，K，Ca的相關反應過程。參與其中的主要細菌菌門包括Epsilonbacteraeota，Verrucomicrobia，Firmicutes，Latescibacteria，Spirochaetes，Proteobacteria。主要真菌菌綱包括Sordariomycetes，Leotiomycetes，Pezizomycetes，Archaeorhizomycetes和Dothideomycetes。

(5) 在干旱、堿性條件下，土壤化學反應相對較弱，多種礦物(元素)難以發生溶解，植物根系—微生物耦合風化作用常是有效的應對措施。這一過程十分復雜，過去常以模擬試驗的方式進行研究，但這與自然狀態下的過程相卻甚遠。本文直接測定四川牡丹生長土壤營養元素含量以及微生物組成，但這種方式難以揭示特定物種的作用。因此在門、綱水平進行研究，并不強調微生物與元素、礦物間的對應關系，而是試圖尋找參與元素循環過程的主要微生物類群以及微生物與之作用的主要元素，以期為使用礦物、礦物—微生物等手段改善四川牡丹及干旱河谷地帶性植被的基質營養條件提供指導或參考。