酸棗仁皂苷緩解阿爾茨海默病模型小鼠的機制研究

范軍朝宋俊杰陳 勇

(河南大學第一附屬醫院麻醉科,河南 開封 475001)

酸棗仁是鼠李科棗屬植物酸棗的干燥成熟種子[1]。 根據古方記載,酸棗仁具有 “治煩心不得眠,虛汗,補中益氣之功效”[2]。 目前人們從酸棗仁中分離得到的化合物已經有超過130 多種,包括皂苷、生物堿、脂肪酸等。 現代藥理學研究發現,酸棗仁皂苷具有鎮靜安神的功效,并且在神經系統、免疫系統及心腦血管方面也有很好的藥理活性[3]。

Wang 等[4]研究證明JuA 作為酸棗仁中含量最高的一種皂苷類成分,它能夠增加海馬神經元中的GABA 受體亞型中mRNA 的表達,下調腸黏膜系統中相關血清素細胞因子水平,改善睡眠。 Jiang 等[5]通過實驗方法比較了酸棗仁中總皂苷、總黃酮及總多糖的鎮靜安神作用,結果發現酸棗仁中總皂苷能夠顯著延長PS 模型小鼠的睡眠時間。 趙啟鐸等[6]研究發現酸棗仁中總皂苷能夠明顯增強小鼠的抗抑郁作用,減少小鼠絕望不動時間。 榮春蕾等[7]研究發現酸棗仁提取物能夠明顯增強小鼠的抗焦慮作用,其作用機制可能是通過提高小鼠腦內GABA含量,進而增強GABAAR1 的表達。 Zhang 等[8]證明酸棗仁總皂苷提取物中主要活性成分是JuA 和JuB,并且它能夠在一定程度上改善由于酒精引起的有記憶障礙小鼠的學習能力。

阿爾茨海默病(Alzheimer’ s disease, AD) 是一種非常常見的老年性神經性病變疾病,也是造成人類癡呆的最主要原因,目前來說還沒有有效的治療措施[9]。 根據調查顯示,65 歲以上的老年人中AD的發病率約為12%左右,而85 歲以上的老年人中AD 的發病率竟然高達50%,目前來說,AD 已經成為老年醫學研究領域中最為重要的課題之一。 如此同時,隨著臨床醫學的發展,麻醉理念及麻醉技術也在不斷更新,老年人在全麻情況下進行臨床手術更是越發廣泛,如何減輕手術過程中全麻手術對老年人AD 等神經性病變的影響是目前來說研究的熱點課題之一[10]。

目前來說,AD 病的發病原因還不是很清楚,可能與患者的遺傳及生活環境有很大的關系,近年來,研究發現全麻藥物也是造成AD 發病的一個因素,但是對于其作用機理研究的非常少[11]。 本研究中,我們發現酸棗仁皂苷能夠緩解七氟烷麻醉對阿爾茨海默病模型小鼠的影響,并且是通過活化線粒體相關的凋亡信號通路,減少Aβ 聚集,降低Tau 蛋白磷酸化,抑制小鼠海馬神經元的凋亡。 本研究的進行為將來開發更安全更有效的聯合麻醉劑提供了新思路。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

60 只,雄性3xTg-AD 小鼠和其背景C57BL/ 6J雄性小鼠,清潔級,2 ～3 月齡,28 ～35 g,購買于中國醫學科學院醫學實驗動物研究所北京協和醫學院比較醫學中心[SCXK(京) 2018-0001],飼養標準嚴格遵循動物實驗室SPF 級動物飼養規范。 于河南大學第一附屬醫院老鼠房[ SYXK ( 京) 2018 -0002]飼養半年左右,9 月齡時,用于后續實驗研究。本研究得到了北京檢驗檢疫技術中心實驗動物倫理委員會批準(SHCIQAFTC-M015),同時在實驗過程中,我們遵照動物實驗3R 原則,對大鼠給予了恰當的人道關懷。

1.2 主要試劑與儀器

分子實驗相關試劑盒購買于美國MPbio;分子實驗相關酶購買于日本TaKaRa; 有機試劑購買于中國國藥;相關抗體購買于美國Abcam;其它試劑及耗材均購買于北京鼎國。

低溫高速離心機購買于美國Thermo Scientific;振蕩器購買于美國SCILOGEX;電熱恒溫干燥箱購買于中國精宏; 超聲振蕩器購買于美國Fisher Scientific; Morris Water Maze 實驗裝置購買于Ethovision XT; 加熱磁力攪拌器購買于德國IKA RCT basic;動物麻醉機購買于美國Harvard;手術器械等購買于美國Fine Science Tools。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及處理方法

9 月齡雄性3xTg-AD 小鼠和其背景C57BL/ 6J小鼠,按照隨機分配原則,分為四組,每組12 只,分別為:野生對照組(生理鹽水)、三轉模型對照組(生理鹽水)、三轉模型麻醉組(生理鹽水+七氟烷)、三轉模型給藥組( 生理鹽水+七氟烷+ZSS)。 所有小鼠,經側腦室分別注射等容生理鹽水或0.1 μg / 4 μL 的酸棗仁皂苷,連續10 d,每天一次。 對照組小鼠吸入2 h 氧,麻醉組和給藥組吸入2 h 1.4% 七氟烷。

1.3.2 水迷宮實驗

(1)水迷宮實驗測量實驗小鼠空間學習記憶能力。 水迷宮實驗中所用裝置購買于Ethovision XT,整個裝置是一個圓形水池,直徑為100 cm,水池深50 cm,水深30 cm,水池壁東、南、西、北四個方位有4 個等距離點的象限,在西南象限處有一直徑為10 cm 的平臺,平臺位于水平面下1 cm 處。 本裝置中池壁是黑色,為了更好的識別黑色小鼠,我們在池中加入牛奶,水池中水溫保持在(25±1)℃,并且整個實驗過程中,要保持房間內光照及物品擺放等室內環境一致性。

(2)不可視平臺實驗。 小鼠在吸入七氟烷或氧氣后的24 h,開始進行不可視平臺實驗。 整個實驗進行5 d,每天在同一時間段訓練4 次。 實驗開始時,將小鼠從東南西北任一方向向池壁放入水中,記錄池壁中小鼠入水點,池周圍設置一個固定的參照物,確保小鼠能夠定位平臺。 水迷宮實驗裝置設有追蹤小鼠游泳軌跡的自動監視裝置,能夠準確的記錄小鼠找到平臺的時間, 也稱為逃避潛伏期(escape latency)。

(3)Probe 實驗。 水迷宮實驗進行的第6 天,將水下平臺撤除,以東北角象限的池壁為小鼠入水點,記錄小鼠在原平臺現象所停留的時間及穿越原平臺所在位置的次數。

(4)可視平臺實驗。 水迷宮第7 天進行可視平臺測定,即將平臺超出水面1 cm,并且用一紅旗做為標記,以東北角現象的池壁為小鼠入水點,將小鼠面對池壁放入水中,記錄小鼠找到平臺的時間。

1.3.3 Western blot 檢測

從-80℃冰箱中取出海馬組織,稱取0.2 g,放入1.5 mL EP 管中,加入500 μL RIPA 裂解液,超聲勻漿3 次,每次10 s,于冰上靜止30 min,4℃,8000 r/ min 離心5 min,將上清液轉移到新的EP 管中,用于后續檢測。

Western blot 試劑盒購買于上海碧云天生物技術,具體方法參見其說明書。

1..3.4 Real-time PCR 技術檢測基因表達情況

從-80℃冰箱中取出海馬組織,液氮中磨碎成粉末,稱取0.1 g 粉末于1.5 mL EP 管中,加1 mL TRIzol 溶液, 萃取RNA, 具體步驟參見TaKaRa TRIzol RNA 提取試劑盒。

RNA 反轉錄成cDNA,具體步驟參見TaKaRa cDNA 反轉錄試劑盒。

針對小鼠中線粒體凋亡信號通路基因BcL-2、Bax、Caspase-3 cDNA 全長序列設計引物,具體引物序列參見表1。 熒光定量PCR 方法按照TaKaRa Real-time PCR 試劑盒的具體步驟與方法,通過定量分析這些基因的表達情況。

1.4 統計學方法

表1 Real-time PCR 相關引物序列Table 1 Real-time PCR related primer sequences

2 結果

2.1 酸棗仁皂苷緩解七氟烷麻醉阿爾茨海默病模型小鼠的學習能力研究

Morris 水迷宮實驗主要是用來測定嚙齒類動物空間學習記憶能力的一種重要方法,對動物腦部海馬組織中與學習記憶相關腦區的結構功能損害非常敏感,經常用來作為評價動物藥效。

本研究中,Morris 水迷宮實驗結果如表2 和表3所示,四組小鼠的逃避潛伏期,尋找平臺的滯留時間和穿梭平臺進行比較,三轉模型對照組小鼠的學習記憶能力明顯比對照組差,而三轉模型麻醉組與三轉模型對照組相比,差異不顯著(P>0.05),無統計學意義。 這個結果說明,七氟烷麻醉對小鼠學習記憶能力沒有損傷。 但是三轉模型給藥組與三轉模型對照組相比,小鼠的學習記憶能力得到了提高,這個結果說明,酸棗仁能夠改善阿爾茨海默病模型小鼠的學習記憶能力。

2.2 小鼠海馬組織中Aβ 聚集情況

Aβ 是AD 發病機理中的核心成分,主要有Aβ1-40 和Aβ1-42 兩種多肽形式,其中Aβ1-42 肽鏈長,疏水性好,也是AD 中的核心蛋白。 Western blot檢測結果如圖1 所示,與對照組相比,三轉模型對照組小鼠中總Aβ、Aβ1-40、Aβ1-42 含量顯著增加,與三轉模型對照組相比,三轉模型麻醉組含量差異不明顯,表明七氟烷麻醉不影響海馬組織中總Aβ、Aβ1-40、Aβ1-42 的含量,與三轉模型對照組相比,三轉模型給藥組小鼠中總Aβ、Aβ1-40、Aβ1-42 含量顯著下降,差異顯著,具有統計學意義(P<0.05)。

表2 四組小鼠Morris 水迷宮逃避潛伏期比較(± s ,n= 6)Table 2 Comparison of Morris water maze escape latency of four groups of mice

表2 四組小鼠Morris 水迷宮逃避潛伏期比較(± s ,n= 6)Table 2 Comparison of Morris water maze escape latency of four groups of mice

注:與三轉模型對照組相比,# P < 0.05,## P < 0. 01;與對照組相比,?P<0.05,??P<0.05。 下表同。Note.Compared with the three-transfer model control group, #P<0.05,##P<0.01.Compared with the control group, ?P < 0. 05,??P < 0.05.The same as below.

對照組Con 57.2±4.4 54.9±3.7 50.5±3.2 47.5±2.9 45.6±3.0模型對照組Model Con 60.8±3.8? 58.3±4.8? 54.8±3.7??50.5±3.3?47.1±3.7?實驗組1 Group 1 61.0±3.5 58.8±3.4? 55.0±3.1? 50.7±2.6?47.3±3.2實驗組2 Group 2 58.1±4.2# 55.3±4.0## 51.0±2.5# 48.2±3.1# 45.7±2.9#

表3 四組小鼠Morris 水迷宮空間探索實驗結果比較(± s ,n= 6)Table 3 Comparison of the results of Morris water maze space exploration experiment in four groups of mice

表3 四組小鼠Morris 水迷宮空間探索實驗結果比較(± s ,n= 6)Table 3 Comparison of the results of Morris water maze space exploration experiment in four groups of mice

組別Groups探索時間(s)Explore time穿越平臺次數(次)Number of crossing platforms (times)對照組Con 41.8±2.2 4.5±1.7模型對照組Model Con 43.4±2.6? 3.2±0.9??實驗組1 Group 1 43.5±3.4? 3.3±1.3?實驗組2 Group 2 42.0±2.8# 4.0±1.5##

圖1 小鼠海馬組織中Aβ 聚集情況Figure 1 Aβ aggregation in mouse hippocampus

2.3 小鼠海馬組織中Tau 蛋白磷酸化情況

Tau 蛋白是細胞內高度磷酸化的微管蛋白,當Tau 蛋白異常聚集形成神經纖維纏結(NFT)的時候會引起微管解體、斷裂,研究發現Tau 蛋白與AD 的發病機制密切相關。 Tau 蛋白磷酸化位點包括絲氨酸396 和262,蘇氨酸231,這些磷酸化位點在AD 發病中有著非常重要的作用。 實驗結果如圖2,與對照組相比,三轉模型對照組小鼠中Tau 蛋白磷酸化含量顯著增加,與三轉模型對照組相比,三轉模型麻醉組含量差異不明顯,表明七氟烷麻醉不影響海馬組織中Tau 蛋白磷酸化的含量,與三轉模型對照組相比,三轉模型給藥組小鼠中Tau 蛋白磷酸化含量顯著下降,差異顯著,具有統計學意義(P<0.05)。

2.4 Real-time PCR 檢測小鼠海馬線粒體相關凋亡信號通路基因表達

線粒體是細胞能量的主要來源,其活性決定了細胞的生死存亡。 AD 發病早期一個重要的特征就是線粒體功能障礙。 當AD 發生時Aβ 和Tau 蛋白聚集會直接損傷線粒體,引起線粒體破裂,導致細胞內細胞色素C 的釋放,細胞凋亡因子Caspase-3的釋放。 Bax 是促凋亡基因,BcL-2 是非常重要的抗凋亡基因,能夠抑制Bax 的活性。 本研究通過Realtime PCR 對線粒體通路相關凋亡基因進行檢測,結果如圖3 所示,與對照組相比,三轉模型對照組中BcL-2 表達減少,Bax 和Caspase-3 表達增強;與三轉模型對照組相比,三轉麻醉組中BcL-2 表達減少,Bax 和Caspase-3 表達增強,這個結果說明,七氟烷麻醉會影響小鼠海馬線粒體活性;與三轉模型麻醉組相比, 三轉給藥組中, BcL-2 表達增強, Bax 和Caspase-3 表達減少,這個結果說明,酸棗仁苷會緩解七氟烷麻醉影響小鼠海馬線粒體活性。

3 討論

酸棗是我國特有的藥用植物,蘊藏量巨大,酸棗仁是其種子,在神經系統疾病方面的研究已有幾千年的歷史。 目前,國內外學者對酸棗仁皂苷進行分離鑒定,發現其成分多達50 多種。 酸棗仁皂苷在鎮靜安神、抗抑郁、抗焦慮以及改善記憶等方面都 有顯著的活性[12]。

圖2 小鼠海馬組織中Tau 蛋白磷酸化情況Figure 2 Phosphorylation of Tau protein in mouse hippocampus

圖3 小鼠海馬線粒體相關凋亡信號通路基因表達Figure 3 Mouse hippocampal mitochondrial related apoptosis signaling pathway gene expression

AD 是致使人類癡呆的主要原因,目前來說,沒有有效的治療措施。 對于其發病原因及形成機制,仍然不是很清楚。 研究表明,全麻藥物能夠增加AD 發病的風險,加重AD 神經病理的改變。 研究發現,病人手術過程中進行全麻能夠加重病人認知功能障礙[13]。 研究表明,全麻藥物加重AD 患者的癥狀和神經病理過程[14]。

Morris 水迷宮實驗是檢測智齒類動物學習記憶能力的一個重要手段,經常用來作為藥物作用效果的評價方法[15]。 根據研究,異氟醚最低肺泡濃度為1.1% ～1.2%, 臨床手術時常用濃度為1.0% ～2.0%,本研究根據這個選擇了本研究中異氟醚麻醉的濃度1.4%。 研究結果發現,Morris 水迷宮實驗發現1.4%七氟烷2 h 對大鼠的學習記憶能力影響不明顯,臨床上患者進行手術時所用麻醉量是1% ～2%之間,這個結果說明,手術時,全麻在一定程度上是安全的,對機體副作用小。

AD 病的發病機理復雜,但是隨著醫學的發展,越來越多與AD 病相關的一些蛋白,調控因子作用被發現[16]。 Aβ 是AD 發病機理中的核心成分,主要有Aβ1-40 和Aβ1-42 兩種多肽形式,其中Aβ1-42 肽鏈長,疏水性好,是AD 中的核心蛋白。 本研究發現1.4%七氟烷2 h 對Aβ 聚集含量影響不大,但酸棗仁皂苷能降低AD 病中Aβ 聚集的含量。

Tau 蛋白是細胞內高度磷酸化的微管蛋白,當Tau 蛋白異常聚集形成神經纖維纏結(NFT)的時候會引起微管解體、斷裂,研究發現Tau 蛋白與AD 的發病機制密切相關。 Tau 蛋白磷酸化位點包括絲氨酸396 和262,蘇氨酸231,這些磷酸化位點在AD發病中有著非常重要的作用。 本研究發現1.4%七氟烷2 h 對Tau 蛋白磷酸化影響不大,但是酸棗仁皂苷能降低AD 病中Tau 蛋白磷酸化的影響。

AD 病神經元發生病變的過程中,一個主要的病理特征就是細胞凋亡的發生。 研究表明,體外細胞培養時,七氟烷處理體外培養細胞時,會誘導細胞凋亡,促進細胞色素C 的釋放,誘導細胞凋亡因子Caspase-3 的釋放[17-18]。 本研究發現1.4%七氟烷2 h 確實引起抗凋亡基因BcL-2 的下調表達,促凋亡基因Bax 和細胞凋亡基因Caspase 上調表達,當用一定濃度的酸棗仁皂苷處理后,抗凋亡基因BcL-2 上調表達,促凋亡基因Bax 和細胞凋亡基因Caspase 發生下調表達。