實驗動物中新型冠狀病毒的感染情況調查

李曉波,王 吉,付 瑞,王莎莎,王淑菁,李 威,秦 驍,黃宗文,賀爭鳴,岳秉飛?,林更濤

(1.中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所,北京 102629; 2.東營市疾病預防控制中心,山東 東營 257091)

由新型冠狀病毒引起的肺炎,截至2020 年6 月24 日,全球感染病例近千萬,死亡近50 萬人。 我國在較短時間內完成了該病毒的鑒定和基因組測序工作,國際病毒專家小組將此次爆發的新型冠狀病毒命名為SARS-CoV-2[1]。 冠狀病毒為有包膜的單股正鏈RNA 病毒,具有跨物種傳播和宿主適應性強等特點。Enserink 等在國際上首次提出2003 年的SARS 冠狀病毒來自蝙蝠,后通過果子貍傳播給人類[2]。 本次新型冠狀病毒溯源及可能的動物中間宿主還不明確,其在除了人類以外的動物中感染情況還不清楚,目前疫情防控重點主要放在人上,而對動物的防控是盲區,動物體內如果存在病毒會對疫情的防控產生巨大威脅。 本研究對實驗小鼠、大鼠、豚鼠、兔及犬中新型冠狀病毒的感染情況進行了初步調查,為實驗動物相關從業人員的防護提供基礎數據,同時對防范新冠病毒的傳播提供一定的依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗動物血清均來自2020 年各實驗動物生產單位送檢樣品[SCXK(京)2017-0005][SYXK(京)2017-0013],其中小鼠血清90 份,編號M1 ～M90;大鼠血清38 份,編號R1 ～R38;豚鼠血清20 份,編號G1～G20;兔血清27 份,編號Ra1 ～Ra27;犬血清5 份,編號C1 ～C5,詳細信息見表1,已通過本院倫理審批(中檢動(福)第2019(A)001 號)。

1.2 主要試劑與儀器

新型冠狀病毒( SARS-CoV-2) 雙抗原夾心ELISA 抗體檢測試劑盒為洛陽普泰生物技術有限公司生產( 2019 獸藥GMP 證字16016 號), 批號:E22A2002S。 酶 標 儀( 美 國Thermo 公 司, 型 號MK3);恒溫培養箱(日本三洋公司,型號MIR-262)。

1.3 實驗方法

1.3.1 ELISA 測定實驗動物血清中新型冠狀病毒抗體

按照ELISA 試劑盒的操作說明檢測實驗動物血清樣品中的新型冠狀病毒抗體,具體步驟如下:

a.加樣:取抗原包被板,每板設陰性對照3 孔,陽性對照2 孔和空白對照1 孔,分別在相應孔中加入待測樣品100 μL,陰、陽性對照每孔加入50 μL,記錄樣品加樣順序。

b.溫育:封板膜封板,37℃溫育30 min。

c.洗板:揭掉封板膜,每孔加滿洗液,靜置30 s,棄掉,重復洗板5 次,最后一次盡量扣干。

d.加酶:每孔加入酶標試劑100 μL,空白孔除外,37℃溫育30 min。

e.洗板:同步驟c。

f.顯色:每孔加入顯色劑A、B 液各50 μL,輕輕振蕩混勻,37℃避光顯色15 min。

g.測定:每孔加入終止液50 μL,輕輕振蕩混勻,設定酶標儀測定波長450 nm,用空白孔調零后測定各孔A 值。

1.3.2 結果判定

陰性對照孔A 值<0.1,陽性對照孔A 值>0.19,實驗成立;臨界值= 0.16+陰性對照孔A 值均值(陰性對照孔低于0.03 按0.03 計算),樣品A 值≥臨界值判為新冠病毒抗體陽性,樣品A 值<臨界值判為新冠病毒抗體陰性。

2 結果

ELISA 結果見表2,陽性對照均值為0.588,陰性對照均值為0.006,實驗成立;計算臨界值= 0.19,根據臨界值判斷90 份小鼠、38 份大鼠、20 份豚鼠、27 份兔及5 份犬血清樣本中新冠病毒抗體均為陰性。

3 討論

ELISA 檢測病毒抗體是實驗動物國家標準常用的病毒檢測方法。 ELISA 具有靈敏度高,特異性好,操作簡便等特點,對動物血清中病毒抗體檢測可顯示動物的既往感染情況,并可避免病毒潛伏感染造成的核酸檢測假陰性結果。 近期北京新增多個病例核酸檢測陰性,而抗體檢測陽性,均可能由于人體免疫系統對病毒進行了一定程度的清除,此時對咽拭子樣本進行核酸檢測就可能出現核酸檢測結果陰性。

本研究采用的ELISA 檢測試劑盒來自洛陽普泰生物技術有限公司,該公司通過了獸藥GMP 認證(2019 獸藥GMP 證字16016 號)。 試劑盒采用雙抗原夾心法檢測病毒抗體,特異性良好,與小鼠肝炎病毒、大鼠冠狀病毒等冠狀病毒屬病毒均無交叉反應。 試劑盒相關內容已制定成團體標準 “T/ CVMA 15-2020 新型冠狀病毒動物血清抗體雙抗原夾心酶聯免疫吸附實驗檢測方法”,且生產單位參與了標準的制定,其檢測性能可靠。 不過抗體檢測也有其局限性,如抗體的產生依賴于動物的免疫狀態,不適用于免疫缺陷動物的檢測;同時抗體的產生需要窗口期,在窗口期檢測會出現假陰性結果,因此后續的實驗還需結合核酸檢測進行研究。

本實驗檢測的樣品既包含了常用品系動物,如KM、BALB / c 小鼠,SD、Wistar 大鼠等,也有各種模式動物,結果顯示新冠病毒抗體均為陰性。 推測可能的原因之一是這些種類的動物機體細胞無新冠病毒受體,因而對新冠病毒不易感。 由于新冠病毒的強致病性和感染性,操作活病毒需要生物安全3級以上實驗室,目前還未有實驗動物人工感染新冠病毒的報道;另一原因可能在于實驗動物是一類特殊群體,飼養環境、微生物狀況、飼養人員、飼料和墊料等均嚴格控制,獲得感染的幾率很小,故新冠病毒抗體為陰性。

表1 實驗動物樣本詳細信息Table 1 Information for laboratory animal samples

表2 實驗動物血清中新冠病毒抗體ELISA 檢測結果Table 2 ELISA test results of anti-coronavirus antibody in serum of experimental animals