類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者髕下脂肪墊及滑膜中炎性因子的水平

李龍杰 劉暢 張磊 張海森 陳思 楊留柱 趙衛(wèi)星 張國(guó)瑜

(1滄州市中心醫(yī)院,河北 滄州 061001;2河間市人民醫(yī)院;3滄州市南皮縣中醫(yī)院;4滄州市孟村回族自治縣醫(yī)院)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是以滑膜慢性炎性滲出為表現(xiàn)的臨床疾病，這種炎性滲出同時(shí)也表現(xiàn)在髕下脂肪墊中〔1〕。但是髕下脂肪墊與滑膜各自在RA病理改變中起到什么樣的作用尚未明確〔2〕。本研究通過測(cè)定RA滑膜及髕下脂肪墊中IL-17和IL-10 mRNA表達(dá)情況，進(jìn)而分析髕下脂肪墊及滑膜在RA中所起作用。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 隨機(jī)選擇2016年9月至2018年9月于滄州市中心醫(yī)院行關(guān)節(jié)置換的RA患者41例。所有患者符合歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟(EU-LAR)2009年制定的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)。男10例，女31例，年齡47～77〔平均(53.43±10.26)〕歲，體重指數(shù)(BMI)22.7～28.0〔平均(25.41±2.37)〕kg/m2，病程3個(gè)月至14年，平均(3.74±1.06)年，手術(shù)位置左膝關(guān)節(jié)27例，右膝關(guān)節(jié)14例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)研究并予以批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①確診為RA者；②符合膝關(guān)節(jié)置換術(shù)實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)者；③術(shù)中取髕下脂肪墊和滑膜病理者；④病例資料完善者；⑤對(duì)本研究知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重的心、肝、腎等臟器功能不全者；②嚴(yán)重未經(jīng)控制的糖尿病患者；③術(shù)中未取病理或取到的病理不能用于后續(xù)研究；④術(shù)前3個(gè)月有非甾體抗生素類藥物應(yīng)用史者；⑤合并其他部位嚴(yán)重感染者；⑥不同意參與本研究者。

1.2研究方法

1.2.1標(biāo)本處理 RA關(guān)節(jié)置換術(shù)中，取關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜及髕下脂肪墊組織送病理，所有標(biāo)本經(jīng)10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，然后進(jìn)行4 μm連續(xù)切片，常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色。

1.2.2逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè) 設(shè)備和試劑：Trizol購自美國(guó)Gibco BRL公司，Taq酶購自大連寶生物公司，模板RNA 2 μg、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購自美國(guó)Promega公司。引物由上海生工生物工程公司合成。UVIpro凝膠圖像分析系統(tǒng)購自美國(guó)Kodak公司。方法：將標(biāo)本通過Trizol方法提取組織總RNA，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min，94℃1 min，68℃30 s，72℃40 s，共計(jì)29個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過1.5%瓊脂糖凝膠電泳60 min，使用UVIpro凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行攝像、掃描、分析。

1.2.3血清檢測(cè) 所有患者術(shù)前給予類風(fēng)濕因子(RF)、紅細(xì)胞沉降率(ESR)、C反應(yīng)蛋白(CRP)檢測(cè)。所有檢查于醫(yī)院生化實(shí)驗(yàn)室和常規(guī)實(shí)驗(yàn)室完成，由資深檢驗(yàn)技師嚴(yán)格按照要求進(jìn)行操作。取患者清晨空腹血5 ml，靜置30 min后，3 000 r/min離心15 min，取上清液進(jìn)行檢測(cè)。RF、CRP采用免疫比濁法測(cè)定，ESR采用魏氏法測(cè)定。

1.3分析指標(biāo) 比較患者手術(shù)前后膝關(guān)節(jié)功能、膝關(guān)節(jié)屈曲程度和疼痛程度，比較患者髕下脂肪墊和滑膜中IL-17 mRNA和IL-10 mRNA表達(dá)水平，使用Pearson法分析髕下脂肪墊和滑膜中IL-17 mRNA和IL-10 mRNA與紐約特種外科醫(yī)院膝關(guān)節(jié)評(píng)分(HSS)、視覺疼痛模擬評(píng)分(VAS)相關(guān)性及其與ESR、CRP、RF水平的相關(guān)性。膝關(guān)節(jié)功能采用HSS評(píng)分〔4〕標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果換算成百分制，分?jǐn)?shù)越高則膝關(guān)節(jié)功能越好。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t及χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson法。

2 結(jié) 果

2.1手術(shù)前后膝關(guān)節(jié)功能比較 41例患者術(shù)后隨訪(20.83±13.03)個(gè)月，患者術(shù)后HSS、膝關(guān)節(jié)屈曲程度均明顯高于術(shù)前，而VAS明顯低于術(shù)前，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見表1。

表1 手術(shù)前后膝關(guān)節(jié)功能比較

2.2髕下脂肪墊和滑膜中IL-17 mRNA和IL-10 mRNA表達(dá)比較 髕下脂肪墊中IL-17 mRNA表達(dá)量明顯低于滑膜，IL-10 mRNA表達(dá)明顯高于滑膜，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見表2。

表2 髕下脂肪墊和滑膜中IL-17 mRNA和IL-10 mRNA表達(dá)比較

2.3髕下脂肪墊和滑膜中IL-17 mRNA和IL-10 mRNA與HSS、關(guān)節(jié)活動(dòng)度、VAS的相關(guān)性 HSS、VAS與髕下脂肪墊和滑膜中的IL-17 mRNA均呈正相關(guān)，與IL-10 mRNA呈負(fù)相關(guān)，關(guān)節(jié)活動(dòng)度與髕下脂肪墊和滑膜中的IL-17 mRNA、IL-10 mRNA無相關(guān)性。見表3。

表3 髕下脂肪墊和滑膜中IL-17 mRNA和IL-10 mRNA與HSS、關(guān)節(jié)活動(dòng)度、VAS的相關(guān)性

2.4髕下脂肪墊和滑膜中IL-17 mRNA和IL-10 mRNA與ESR、CRP、RF水平的相關(guān)性 髕下脂肪墊和滑膜中IL-17 mRNA和IL-10 mRNA與ESR、CRP、RF水平無相關(guān)性(P>0.05)，見表4。

表4 髕下脂肪墊和滑膜中IL-17 mRNA和IL-10 mRNA與ESR、CRP、RF水平的相關(guān)性

3 討 論

RA是一種以對(duì)稱性多關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)的自身免疫性疾病，膝關(guān)節(jié)是最常累及的關(guān)節(jié)之一，具有較高的致殘率〔5〕。RA的病因尚不明確，既往研究認(rèn)為滑膜炎是最基本的病理改變，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形甚至功能喪失。但隨著對(duì)疾病研究的深入，髕下脂肪墊的作用日益被重視〔6〕。

髕下脂肪墊是位于髕腱后方的結(jié)締組織，背覆滑膜，脂肪組織是其主要結(jié)構(gòu)，另外還含有能夠產(chǎn)生免疫細(xì)胞的成纖維細(xì)胞〔7〕。迄今為止，髕下脂肪墊的功能尚未完全研究清楚。有研究表明髕下脂肪墊中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子越高，血管數(shù)量越多，而單核細(xì)胞趨化蛋白和IL-6蛋白的水平就越高，組織炎癥浸潤(rùn)程度就越高，并且具有豐富的神經(jīng)纖維，因此被認(rèn)為是膝關(guān)節(jié)髕下疼痛的一個(gè)原因〔8〕。研究證據(jù)表明，髕下脂肪墊與滑膜是單個(gè)功能單元的兩個(gè)組成成分，而不是兩個(gè)單獨(dú)的組織。隨著髕下脂肪墊研究深入，有研究提出髕下脂肪墊是炎癥的來源組織，是具有神經(jīng)支配與血管化的組織，引起膝前疼痛〔9〕。有研究證實(shí)在髕下脂肪墊及滑膜組織中均存在神經(jīng)肽P物質(zhì)，能刺激如IL-1β、IL-6、IL-8等炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并且可促進(jìn)滑膜中細(xì)胞增殖和肥大，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)的進(jìn)展〔10〕。

已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)CD4+T細(xì)胞在骨性關(guān)節(jié)炎疼痛的發(fā)生發(fā)展中有重要作用，而炎性因子IL-10、IL-17在這一過程中起到了關(guān)鍵的作用〔11〕。滑膜及髕下脂肪墊中均存在免疫細(xì)胞因子，CD4+Th細(xì)胞活化后可以分泌出IL-10、IL-17等細(xì)胞因子，它們?cè)赗A的發(fā)生、加重或減輕過程中發(fā)揮著不同的作用。IL-17是新近發(fā)現(xiàn)的重要的促炎因子，它能誘導(dǎo)產(chǎn)生如IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)等炎癥因子，也可誘導(dǎo)如巨核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1、巨核細(xì)胞誘導(dǎo)蛋白(MIP)-2、細(xì)胞趨化因子(CXCL)8等趨化細(xì)胞因子〔12〕，另外還可誘導(dǎo)金屬基質(zhì)蛋白酶(MMP)-1的過度表達(dá)，從而在RA滑膜中細(xì)胞炎性反應(yīng)浸潤(rùn)中起到重要作用。IL-10是Treg細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，主要由活化的 Th2 細(xì)胞和 CD+T細(xì)胞產(chǎn)生〔13〕。研究證實(shí)IL-10具有抑制炎癥作用，與促炎細(xì)胞因子IL-17作用相反，可以抑制多種細(xì)胞合成，在天然免疫反應(yīng)過程中起著重要的負(fù)調(diào)節(jié)作用，有廣泛的抑制活性〔14〕。IL-10主要表達(dá)在RA患者滑膜單核細(xì)胞膜上，或存在于 RA 滑液中，具有強(qiáng)效的抗炎作用，可減輕關(guān)節(jié)腫脹，抑制炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，改善軟骨退化等作用，IL-10的分泌缺乏將導(dǎo)致各種炎癥過程，甚至?xí)?dǎo)致炎癥持續(xù)和不可逆組織損傷〔15〕。

本研究結(jié)果說明膝關(guān)節(jié)置換術(shù)對(duì)于改善RA膝關(guān)節(jié)功能具有較好的療效。髕下脂肪墊中抑炎性因子水平更高。考慮在RA的病情發(fā)生和發(fā)展的過程中，髕下脂肪墊起到了更為重要的作用。IL-17水平越高，患者臨床癥狀越嚴(yán)重，而IL-10水平越高，患者臨床癥狀越輕，IL-10是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的保護(hù)性因素。但是IL-17和IL-10與ESR、CRP、RF水平無相關(guān)性，考慮可能是影響ESR、CRP、RF水平的因素較多所致。