氧化苦參堿對病毒性心肌炎小鼠心肌中Bcl-2及Bax表達的影響及意義

田琳 何春枝 陳詠麗 董善武

(武漢市第四醫院 華中科技大學同濟醫學院附屬普愛醫院兒科，湖北 武漢 430000)

臨床醫學將由病毒感染導致的心肌組織炎癥病變稱為病毒性心肌炎，是一種臨床較為常見的感染性心肌疾病〔1，2〕。病毒性心肌炎主要臨床表現為發熱、倦怠、惡心嘔吐等，隨著病情的發展會出現胸痛、心悸、呼吸困難等癥狀〔3〕。目前臨床較為常用的治療病毒性心肌炎的手段為使用抗病毒藥物進行治療，但治療效果并不十分理想，因此許多專家學者致力于使用中藥治療病毒性心肌炎的研究。氧化苦參堿是一種廣譜的生物堿，主要提取自苦參、廣豆根，具有抗炎、抑瘤、利尿、調節免疫等諸多藥理作用，臨床用途較廣泛，氧化苦參堿具有神經保護及心肌細胞保護作用，但是關于氧化苦參堿治療病毒性心肌炎的研究還較少〔4，5〕。本研究建立病毒性心肌炎小鼠模型，使用氧化苦參堿干預，觀察效果。

1 材料與方法

1.1材料 選取25只SD雄性小鼠〔湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，生產許可證號：SCXK(湘)2016-0002，實驗單位使用許可證號：SYXK(湘)2015-0017〕，3～6月齡，平均(4.5±1.3)月齡，體重212～247 g，平均體重(228.9±12.5)g。小鼠均于干凈籠子內喂養，喂養環境設定為室溫(22.5±2.6)℃，相對濕度35%～40%，光照12 h/d，喂養7 d。本研究獲醫院倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1建模及分組 隨機選取5只小鼠為正常組，不做處理，其余20只小鼠建立病毒性心肌炎模型：使用0.2 ml CVB3病毒稀釋液對小鼠進行腹腔注射接種，共接種4次，每兩次之間間隔5 d，第4次接種1 d之后開始用藥干預。正常組與模型組小鼠均使用生理鹽水進行干預；藥物對照組小鼠使用100 mg/kg利巴韋林溶液進行干預，1次/d；低劑量組小鼠使用6.25 mg/kg氧化苦參堿溶液進行干預，1次/d；高劑量組小鼠使用25 mg/kg氧化苦參堿溶液進行干預，1次/d。各組小鼠均干預14 d。

1.2.2心功能指標檢測 對所有大鼠進行麻醉處理，使小鼠保持仰臥位并進行固定、剃毛。將小鼠的軀體向左傾斜30°左右，并將多普勒超聲檢測儀探頭置于小鼠胸骨的左側，使探頭與小鼠胸骨中線部位保持10～30°夾角，對心功能指標進行檢測。

1.2.3蘇木素-伊紅(HE)染色 對各組小鼠進行全麻處理，采用斷頭法處死，取心尖部心肌組織，液氮冷凍后常規脫水、透明、石蠟包埋，間距5 mm做連續切片。將切片烤干后進行脫蠟處理，之后順序置入不同濃度的酒精中各復水3 min。使用蘇木素染色15 min后清洗3次，使用鹽酸酒精分化處理30 s，充分清洗之后使用1%伊紅染色，使用酒精進行脫水處理后進行脫蠟處理，封片后使用顯微鏡進行觀察。

1.2.4指標檢測 使用酶法速率法檢測乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌酸激酶(CK)水平；酶聯免疫吸附試驗法檢測白細胞介素(IL)-8、C反應蛋白(CRP)、腫瘤壞死因子(TNF)-α水平；使用免疫透射比濁法檢測丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)水平；使用Western印跡法檢測B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)相對表達量。

1.3統計學方法 采用SPSS20.0統計軟件進行F值檢驗、單因素分析。

2 結 果

2.1心肌組織病理學觀察 正常組心肌纖維排列整齊且胞質豐富均勻，細胞間隙正常，無病理變化；模型組可見多數炎性細胞浸潤，且伴有心肌細胞壞死情況，高劑量組炎性細胞浸潤及心肌細胞壞死情況明顯緩解，心肌纖維數量增多，心肌損傷獲得改善。見圖1。

圖1 各組心肌組織病理組織學觀察(HE，×200)

2.2各組心功能指標水平比較 模型組左室舒張末期內徑(LVEDd)、左室收縮末期內徑(LVESd)水平高于正常組，左室射血分數(LVEF)水平低于正常組，具有統計學差異(P<0.05)；藥物對照組、低、高劑量組LVEDd、LVESd水平均低于模型組，LVEF水平高于模型組，且高劑量組LVEDd、LVESd水平均低于藥物對照組、低劑量組，LVEF水平高于藥物對照組、低劑量組，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.3各組LDH、CK-MB、CK水平比較 模型組LDH、CK-MB、CK水平均高于正常組，具有統計學差異(P<0.05)；藥物對照組、低、高劑量組LDH、CK-MB、CK水平均低于模型組，且高劑量組LDH、CK-MB、CK水平均低于其他兩組，具有統計學差異(P<0.05)。見表1。

表1 各組心功能指標水平及LDH、CK-MB、CK水平比較

2.4各組IL-8、CRP、TNF-α水平比較 模型組IL-8、CRP、TNF-α水平均高于正常組，具有統計學差異(P<0.05)；藥物對照組、低、高劑量組IL-8、CRP、TNF-α水平均低于模型組，且高劑量組IL-8、CRP、TNF-α水平均低于其他兩組，具有統計學差異(P<0.05)。見表2。

2.5各組MDA、SOD、GSH-Px水平比較 模型組MDA水平高于正常組，SOD、GSH-Px水平低于正常組，具有統計學差異(P<0.05)；藥物對照組、低、高劑量組MDA水平低于模型組，SOD、GSH-Px水平高于模型組，且高劑量組MDA水平低于藥物對照組、低劑量組，SOD、GSH-Px水平高于藥物對照組、低劑量組，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組IL-8、CRP、TNF-α、MDA、SOD、GSH-Px水平比較

2.6各組Bcl-2、Bax相對表達量對比 模型組Bcl-2表達低于正常組，Bax表達高于正常組；藥物對照組、低、高劑量組Bcl-2表達高于模型組，Bax表達低于模型組，且高劑量組Bcl-2表達高于藥物對照組、低劑量組，Bax表達低于藥物對照組、低劑量組，具有統計學差異(P<0.05)。見表3。

表3 各組Bcl-2、Bax相對表達量對比

3 討 論

臨床研究表明，病毒性心肌炎癥狀的發生發展會對患者心功能造成嚴重的影響，LVEDd、LVESd、LVEF是臨床較為常用的評價機體心功能的指標〔6,7〕。本研究結果說明使用氧化苦參堿干預能夠明顯改善病毒性心肌炎小鼠心功能。

CK、CK-MB、LDH能夠較為直觀、準確地反映出機體心肌損傷的程度，其表達水平的變化與病毒性心肌炎的發生發展密切相關。CK在機體心肌及骨骼肌中大量表達，是較為常用的心血管疾病的診斷指標〔8〕；CK-MB作為CK的特異性同工酶，在機體心肌細胞中大量表達〔9〕；LDH作為一種非特異性心肌酶，在心肌組織中大量表達〔10〕。本研究結果顯示，病毒性心肌炎小鼠CK、CK-MB、LDH水平呈現異常高表達，使用高劑量氧化苦參堿進行干預后，CK、CK-MB、LDH水平明顯下降，出現這一研究結果的原因可能是使用高劑量氧化苦參堿進行干預，能夠減輕病毒性心肌炎小鼠心肌組織損傷嚴重程度，調控CK、CK-MB、LDH水平。

病毒性心肌炎癥狀的發生發展通常會伴隨機體炎癥反應〔11〕。IL-8水平與炎癥反應密切相關〔12〕。CRP主要由肝臟合成的糖蛋白，在人機體出現炎性反應、腫瘤及組織損傷時，其會呈現出高表達的狀態，屬于一種急性期反應物，在臨床上常被用作檢測炎性反應及免疫防御功能的標志物〔13〕。TNF-α一種多功能炎癥細胞因子，能夠介導嗜酸性粒細胞、淋巴細胞在炎癥部位聚集，刺激這些細胞產生IL-6、IL-8等因子，從而使機體產生持續存在的炎癥反應〔14〕。本研究結果說明病毒性心肌炎的發生發展伴隨著機體心肌組織炎癥反應。使用高劑量氧化苦參堿進行干預后，IL-8、CRP、TNF-α水平明顯下降，說明使用氧化苦參堿進行干預，能夠調控IL-8、CRP、TNF-α水平，減輕病毒性心肌炎小鼠心肌組織炎癥反應，從而起到心肌保護作用。

MDA是一種脂質過氧化的重要產物，MDA的異常表達會加劇細胞膜的受損傷程度，還可以影響線粒體呼吸鏈復合物及線粒體內關鍵酶活性〔15〕。SOD是一種可以對超氧陰離子的自由基進行清除的一種抗氧化酶，在機體中廣泛存在，是細胞膜系統結構和功能完整性的保護性酶〔16〕。GSH-Px作為一種重要的過氧化物酶，能夠將機體內的過氧化氫及對機體有害的過氧化代謝產物清除，從而保護機體細胞結構及功能的完整性〔17〕。本研究結果說明氧化苦參堿能夠調控MDA、SOD、GSH-Px水平，從而起到改善病毒性心肌炎小鼠抗氧化能力、減輕心肌細胞氧化損傷嚴重程度的作用。

病毒性心肌炎癥狀的發生發展誘發機體心肌細胞凋亡〔18〕。Bcl-2、Bax是線粒體細胞凋亡通路中的重要基因，二者表達水平的變化與細胞凋亡密切相關〔19,20〕。本研究結果說明氧化苦參堿能夠對Bcl-2、Bax的表達進行調控，從而起到抑制病毒性心肌炎小鼠心肌細胞凋亡、減輕心肌受損嚴重程度的作用。

綜上所述，使用高劑量氧化苦參堿對病毒性心肌炎小鼠進行干預，能夠改善小鼠心功能及心肌酶水平，抑制炎癥反應，提升抗氧化能力，調控Bcl-2、Bax的表達，減輕小鼠心肌受損嚴重程度。