黃芩素通過煙酸受體抑制胃癌細(xì)胞增殖

花文峰，李婕，嚴(yán)芳，楊華文，張智，曹東林

（廣東省第二人民醫(yī)院，廣東 廣州 510317，1.醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心；檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部）

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，在我國惡性腫瘤中發(fā)病率和病死率均僅次于肺癌。最新的腫瘤流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)表明，2015年有67.91萬新發(fā)胃癌患者和49.8萬腫瘤患者死于胃癌[1]。目前，胃癌治療的手段仍以手術(shù)為主，強(qiáng)調(diào)綜合治療。但由于胃癌的早期并無明顯的癥狀，多數(shù)表現(xiàn)為上腹不適、噯氣等非特異性癥狀，導(dǎo)致早期的診斷率較低，而錯(cuò)過了最佳的手術(shù)時(shí)機(jī)。胃癌術(shù)后的輔助化學(xué)治療是以腫瘤細(xì)胞毒性藥為主，主要的化療藥物包括抗代謝藥、烷化劑、抗生素類以及植物類藥[2]。而近年來，研究發(fā)現(xiàn)中藥作為胃癌術(shù)后的輔助用藥獨(dú)具特色，主要以活血理氣、解毒消積的方劑為主，結(jié)合辨證酌情活用溫腎健脾、養(yǎng)陰清熱、理氣降逆、化瘀軟堅(jiān)、消食導(dǎo)滯等藥，以扶助正氣，增強(qiáng)脾胃運(yùn)化功能，使攻中有補(bǔ)、攻補(bǔ)兼施，在改善癥狀、控制腫瘤生長和延長患者生存方面均取得了較好的效果[3-5]。

中藥黃芩為唇形科植物黃芩的干燥根[6]。黃芩作為我國的傳統(tǒng)藥物，已有2 000多年的應(yīng)用歷史，其在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為中品，具有“主治諸熱，黃疸，腸癖，泄痢，逐水，下血閉，惡瘡，疽蝕，火瘍”。臨床上黃芩既可以單獨(dú)使用也可以與其他中藥配伍，主要用于治療呼吸道感染、急性菌痢和病毒性肝炎等[6-9]。研究發(fā)現(xiàn)，黃芩素（Baicalein）是黃芩中含量較高的黃酮類化合物之一，在體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究表明黃芩素在胃腸道易被吸收，且生物利用度高[7，10]。研究發(fā)現(xiàn)黃芩素還可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長，特別是在消化系統(tǒng)，黃芩素可以誘導(dǎo)結(jié)腸癌和胃癌細(xì)胞的凋亡，但其作用的靶點(diǎn)和具體分子機(jī)制仍不清楚[11-18]。

G蛋白偶聯(lián)受體作為體內(nèi)最大的蛋白質(zhì)超家族，廣泛存在于生物體細(xì)胞膜上，其在細(xì)胞中的表達(dá)或功能失調(diào)，與腫瘤的發(fā)生、浸潤和轉(zhuǎn)移密切相 關(guān)[19]。新近研究發(fā)現(xiàn)煙酸受體（GPR109A）在結(jié)直腸癌和乳腺癌中發(fā)揮腫瘤抑制的功能[20-21]。本研究探索黃芩素的抗腫瘤作用是否與調(diào)控?zé)熕崾荏w的表達(dá)相關(guān)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞：胃癌細(xì)胞株（MGC80-3、HGC-27、BGC-823）與人胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1由中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所提供。

1.1.2 主要試劑：黃芩素（Catalog No.S2268，美國Selleck公司），Cell Counting Kit-8（CCK-8，日本Dojindo公司），胎牛血清（FBS，美國Gibco公司），兔抗GPR109A多克隆抗體（NBP1-92180，1:100；美國Novus公司），兔抗α-Tubulin單克隆抗體（ab24246，1:10 000；美國Abcam公司），山羊抗兔二抗（SA00001-2，1:10 000；美國Proteintech公司），GPR109A表達(dá)質(zhì)粒（美國GeneCopoeia公司），ECL化學(xué)發(fā)光液、Lipofectamine 2000、Lipofectamine RNAi MAX（美國Thermo Fisher Scientific公司），GPR109A siRNA序列及陰性對照siNC（廣州Ribobio 公司），Transwell小室和基質(zhì)膠（美國Becton Dickinson公司）。

1.1.3 主要設(shè)備：細(xì)胞培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），低溫高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司），電泳儀（美國Bio-Rad公司），高速離心機(jī)（美國Beckman公司），倒置顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：人胃癌MGC80-3、HGC-27與BGC-823細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中。永生化人正常胃上皮GES-1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)液中。細(xì)胞均置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 CCK-8實(shí)驗(yàn)：取對數(shù)生長期的細(xì)胞，以每孔2×103個(gè)細(xì)胞接種至96孔板，設(shè)6個(gè)復(fù)孔，每組各接種4塊96孔板，常規(guī)培養(yǎng)。第2天起，每天同一時(shí)間每組各取一塊96孔板每孔加入10 μL CCK-8并置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，取出用酶標(biāo)儀讀取吸光值（波長為450 nm），共4 d。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，酶標(biāo)儀讀取數(shù)值為縱坐標(biāo)繪制各組細(xì)胞的生長曲線圖。

1.2.3 Transwell遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)：遷移實(shí)驗(yàn)采用8 μm孔徑的Transwell小室，而侵襲實(shí)驗(yàn)所用小室則需先用基質(zhì)膠（按1:3稀釋）包被于Transwell小室微孔濾膜上，放置37 ℃孵育5 h后才能加入細(xì)胞。 取5×105個(gè)細(xì)胞加入上室，上室培養(yǎng)液為無血清完全培養(yǎng)基，下室為20% FBS完全培養(yǎng)基，每組重復(fù)3孔，繼續(xù)培養(yǎng)12 h（遷移）或24 h（侵襲）后取出小室，棉簽擦盡上室面的細(xì)胞，95%乙醇固定，0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色。于200倍光鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)濾膜下室面的細(xì)胞數(shù)，取均數(shù)作為遷移和侵襲的指數(shù)（細(xì)胞個(gè)數(shù)/視野）。

1.2.4 Western blot實(shí)驗(yàn)：取質(zhì)粒轉(zhuǎn)染72 h后或黃芩素處理48 h后的細(xì)胞，用預(yù)冷的1×PBS洗滌后加入1×Lysis buffer裂解液，冰上靜置裂解15 min 后，用細(xì)胞刮迅速刮下細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，4 ℃，12 000×g條件下離心15 min，收集上清液；采用BCA法測定蛋白濃度；取40 μg蛋白加熱變性，用10%的SDS-PAGE分離膠及5%的濃縮膠對樣品進(jìn)行電泳，電泳完成后，取出凝膠與PVDF膜，加入1×轉(zhuǎn)移緩沖液進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)完膜后用1×TBST洗滌5 min， 加入封閉液（用TBST配5%脫脂牛奶），室溫封閉1 h。棄封閉液，用1×TBST洗3次，加入一抗孵育4 ℃過夜，取出膜用1×TBST室溫洗3次，加入二抗孵育1 h， 用1×TBST洗膜3次，加入ECL化學(xué)發(fā)光液，進(jìn)行顯影，定影。

1.2.5 細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)：轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前1 天，將2×105個(gè)/孔胃癌細(xì)胞均勻地接種到6 孔板中，約18～24 h后，細(xì)胞面積達(dá)到70%～90%時(shí)開始進(jìn)行轉(zhuǎn)染。一管加入100 μL Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋2 μg質(zhì)粒，一管加入100 μL Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋4 μL Lipofectamine 2000，室溫放置5 min后，將稀釋的Lipofectamine 2000加入到稀釋好的質(zhì)粒中，輕彈管壁混勻，室溫放置15～20 min，將待轉(zhuǎn)染混合物200 μL，逐滴均勻加入孔中，搖動(dòng)培養(yǎng)皿使其均勻分布于培養(yǎng)液當(dāng)中，轉(zhuǎn)染4～6 h后，更換新鮮完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。

圖1 黃芩素對胃癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的抑制作用

1.2.6 RNA干擾實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)前1天消化細(xì)胞，并按2×105個(gè)/孔胃癌細(xì)胞均勻地接種到6孔板中，并用10% FBS無雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)18～24 h。實(shí)驗(yàn)前將5 μL 20 μmol/L siRNA稀釋于 200 μL Opti-MEM中，輕彈管壁混勻；將5 μL Lipofectamine RNAi MAX稀釋于200 μL Opti-MEM中，輕彈管壁混勻；將RNAi MAX/siRNA混合物室溫放置15～20 min，然后逐滴加入細(xì)胞中，混勻后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染6 h后，更換新鮮完全培養(yǎng) 液，繼續(xù)培養(yǎng)并用于后續(xù)的黃芩素處理實(shí)驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析；重復(fù)測量資料的比較采用重復(fù)測量資料方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芩素抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲能力 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相對于對照組（0 μmol/L）， 10 μmol/L與50 μmol/L的黃芩素在第4天時(shí)均能顯著抑制胃癌細(xì)胞MGC80-3、HGC-27與BGC-823的增殖，且黃芩素50 μmol/L組的抑制作用強(qiáng)于10 μmol/L 組，提示黃芩素抑制胃癌細(xì)胞的增殖具有劑量效應(yīng)作用（P＜0.05），見圖1A-C。進(jìn)一步的體外遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，10 μmol/L與50 μmol/L的黃芩素均能顯著抑制胃癌細(xì)胞MGC80-3與HGC-27的遷移與侵襲能力，且黃芩素50 μmol/L 組比10 μmol/L組的抑制作用更顯著（P＜0.05），見圖1D-E。

2.2 過表達(dá)GPR109A抑制胃癌細(xì)胞增殖 GPR109A蛋白在胃癌細(xì)胞中均為低表達(dá)（見圖2A）。選取MGC80-3與HGC-27細(xì)胞進(jìn)行GPR109A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染72 h后檢測GPR109A蛋白的表達(dá)，可見GPR109A蛋白的表達(dá)均顯著上調(diào)（見圖2B-C）。通過CCK-8檢測GPR109A過表達(dá)對MGC80-3與HGC-27細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)GPR109A也可顯著抑制MGC80-3與HGC-27細(xì)胞的增殖（見圖2D-E）。

圖2 過表達(dá)GPR109A抑制胃癌細(xì)胞的增殖

2.3 沉默GPR109A表達(dá)對黃芩素抑制胃癌細(xì)胞增殖的影響 黃芩素可明顯上調(diào)GPR109A蛋白的表達(dá)，且50 μmol/L組比10 μmol/L組的作用更顯著（P＜0.05），見圖3A-B。進(jìn)一步，通過RNA干擾GPR109A的表達(dá)后觀察黃芩素對胃癌細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默GPR109A的表達(dá)可顯著降低黃芩素對胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用（P＜0.05），見圖3C-F。

3 討論

中藥黃芩具有“清熱燥濕，瀉火解毒，止血，安胎”的功效，臨床主要用于治療呼吸道感染、急性菌痢和病毒性肝炎等疾病，是中醫(yī)常用的藥物之 一[6-9]。由于黃芩素是黃芩中最重要的生物活性物質(zhì)之一，近年來有眾多研究針對黃芩素進(jìn)行了體內(nèi)外的抗腫瘤研究，結(jié)果表明黃芩素具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用且毒副作用較小，用藥安全性高，但其作用的靶點(diǎn)及機(jī)制仍不清楚[11-18]。研究發(fā)現(xiàn)，黃芩素可顯著抑制胃癌細(xì)胞AGS、MKN-28、SGC7901和MGC-80-3的增殖、遷移或侵襲[16-18，22-24]。同樣，我們的研究也發(fā)現(xiàn)黃芩素可以顯著抑制胃癌細(xì)胞MGC80-3、HGC-27與BGC-823的增殖，以及MGC80-3和HGC-27細(xì)胞的遷移與侵襲。但是，黃芩素作用于胃癌的分子靶點(diǎn)目前還不清楚。

有研究發(fā)現(xiàn)屬于抑制性G蛋白偶聯(lián)受體（Gi）的煙酸受體（GPR109A）在結(jié)直腸癌和乳腺癌中過表達(dá)可發(fā)揮抗腫瘤的作用[19-21]。目前發(fā)現(xiàn)GPR109A受體主要表達(dá)于白色脂肪、棕色脂肪、脾和免疫細(xì)胞，并對血脂、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和脂肪儲(chǔ)存具有重要的調(diào)節(jié)、維持與促進(jìn)的作用[25-26]。另外，研究也發(fā)現(xiàn)GPR109A的表達(dá)具有抗炎作用[27]。考慮到慢性炎癥對胃癌的發(fā)生發(fā)展具有的重要作用[28]，我們推測GPR109A的表達(dá)可能對胃癌細(xì)胞的生長具有抑制作用。為此，本研究通過蛋白檢測證明GPR109A 在胃癌細(xì)胞中存在較低的表達(dá)，而在永生化人正常胃上皮細(xì)胞GES-1中則存在較高的表達(dá)。我們進(jìn)一步在胃癌細(xì)胞中過表達(dá)GPR109A并檢測其對胃癌細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明，過表達(dá)GPR109A能顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖。我們通過RNA干擾實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，沉默GPR109A的表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)黃芩素對胃癌細(xì)胞的增殖抑制作用，結(jié)果表明GPR109A是黃芩素抑癌效應(yīng)的作用靶點(diǎn)之一，這為進(jìn)一步闡明黃芩素發(fā)揮抑癌作用的功能與分子機(jī)制提供了研究思路。

圖3 黃芩素上調(diào)GPR109A的表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞的增殖作用