丙酸鈉通過抑制NLRP3保護膿毒癥大鼠的結腸組織

謝獻政，楊然棟，陳肖鳴

（1.溫州醫科大學附屬第一醫院 小兒外科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院 小兒外科，浙江 溫州 325027）

膿毒癥是重癥監護室患者常見的死亡原因[1]。腸道是膿毒癥諸多受損器官中受累最早的器官，同時腸道受損又能促進膿毒癥全身炎癥反應[2-3]。膿毒癥時，腸道組織中炎性因子分泌和釋放增加，腸黏膜屏障受到破壞，有害物質更易進入機體并隨血液循壞播散至全身各處[4]。NLRP3炎性小體是目前研究最多的一種炎性小體。NLRP3炎性小體被激活后，能調節caspase-1的活化，產生和分泌成熟的IL-1β和IL-18，參與炎癥反應。研究表明，NLRP3炎性小體可能參與膿毒癥的發生進展，影響疾病的嚴重程度和預后[5]。

短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFA）是細菌在腸道中發酵膳食纖維產生的主要代謝產物，主要包括乙酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽等。SCFA在維持腸道穩態以及腸道上皮細胞的形態和功能方面具有重要作用[6-7]。近年來，有報道表明丙酸鹽在葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium salt，DSS）引起的結腸炎模型中，可以通過減少炎癥和氧化應激來改善腸屏障功能[8]。但目前仍未見丙酸鹽在膿毒癥這一方面的研究。在本研究中，我們將探究丙酸鈉（sodium propionate，SP）對膿毒癥的結腸損傷是否具有保護作用，并研究其對NLRP3炎性小體的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：清潔級雄性Sprague-Dawley大鼠80只，體質量180～200 g，6～8周齡，由溫州醫科大學實驗動物中心提供，動物許可證號：SYXK（浙）2018-0017。

1.1.2 主要試劑：ELISA檢測試劑盒購自美國R&D公司；SP購自美國Sigma公司；claudin-1、occludin、NLRP3、caspase-1、IL-β、IL-18 一抗購自美國Affinity公司；beclin-1、LC3 II一抗購自美國CST公 司，HE染色試劑購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 膿毒癥動物模型的建立：采用盲腸結扎穿刺法（cecum ligation and puncture，CLP）建立膿毒癥模型。SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、假手術+SP組和模型+SP組（Sham、CLP、Sham+SP和CLP+SP），每組20只。CLP組、CLP+SP組大鼠用戊巴比妥鈉麻醉并固定，腹部消毒，并予正中切口，分離暴露盲腸，將盲腸遠端結扎并用針頭對穿2次，將盲腸收納回腹，逐層關腹。Sham組、Sham+SP組大鼠僅打開腹腔，暴露盲腸，不予結扎穿孔，逐層關腹。處理后0.5 h和4 h后給予Sham+SP和CLP+SP組大鼠腹腔注射200 mg/kg SP。Sham組和CLP組注射等量 0.9%氯化鈉溶液。處理24 h后，處死各組10只大 鼠，收集結腸組織，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 生存率的檢測：每隔12 h觀察各組剩余10只大鼠的存活情況，記錄大鼠3 d的存活率。

1.2.3 觀察指標：HE染色觀察各組大鼠結腸結構變化；ELISA檢測結腸組織中IL-6、TGF-β和TNF-α含量；Western blot和免疫組化染色檢測結腸緊密連接蛋白（claudin-1和occludin）和NLRP3炎性小體的表達情況。

1.3 統計學處理方法 利用GraphPad Prism 6軟件進行統計分析并繪制生存曲線；多組間比較用單因素方差分析；計數資料比較用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SP對膿毒癥大鼠生存率的影響 SP對CLP組大鼠72 h生存率的影響見圖1。Sham組和Sham+SP組動物72 h內均無死亡。CLP組大鼠72 h生存率為10%，CLP+SP組大鼠72 h的存活率為50%，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 SP減輕膿毒癥大鼠結腸組織病理損傷 Sham組和Sham+SP組中結腸組織大體觀無明顯變化，表面光滑，無水腫充血，鏡下觀黏膜上皮完整連續，腺體排列規則，結構清楚，無炎性細胞浸潤。CLP組大體觀充血水腫，鏡下觀黏膜上皮間斷缺失，腺體排列紊亂，腺體間有炎性細胞浸潤等現象。與CLP組相比，CLP+SP組的黏膜上皮缺失、腺體排列紊亂和炎性細胞浸潤較少。見圖2。

2.3 SP減少膿毒癥大鼠結腸組織的炎癥因子 CLP處理后大鼠的結腸組織中，三種炎癥細胞因子的濃度增加（P＜0.05）。而SP明顯抑制了CLP誘導的炎癥細胞因子濃度的升高（P＜0.05）。見圖3。

圖1 各組大鼠生存率比較（n=10）

圖2 各組大鼠結腸組織HE染色

圖3 各組大鼠TNF-α、IL-6和TGF-β含量變化

2.4 SP增加膿毒癥大鼠結腸緊密連接蛋白表達 Western blot結果顯示（見圖4），Sham組和Sham+ SP組的緊密連接蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05）。CLP組的claudin-1和occludin蛋白表達與Sham組比降低（P＜0.05）。與CLP組相比，CLP+SP組claudin-1和occludin的蛋白表達有所增加（P＜ 0.05）。此外，各組結腸組織中claudin-1和occludin的免疫組化染色結果（見圖5）與上述Western blot結果一致（P＜0.05）。

2.5 SP抑制膿毒癥大鼠結腸NLRP3炎性小體激活 Sham組和Sham+SP組NLRP3、caspase-1、IL-β和IL-18 的蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05）。CLP組NLRP3、caspase-1、IL-β和IL-18 的蛋白表達顯著高于Sham組（P＜0.05）。而與CLP組相比，CLP+SP組這些蛋白的表達顯著降低（P＜0.05）。此外，各組的NLRP3和caspase-1免疫組化染色結果與上述Western blot結果一致，CLP+SP組的表達較CLP組有所降低（P＜0.05）。見圖6-7。

圖4 各組大鼠結腸組織occludin、claudin-1蛋白表達情況

3 討論

丙酸鹽是腸道菌群在宿主腸道內的主要代謝產物之一。據報道，丙酸鹽可減少LPS刺激的中性粒細胞TNF-α的釋放，抑制NF-κB的基因表達，具有抗炎作用[9]。前期研究發現在大鼠哺乳期丙酸鹽可通過增加緊密連接蛋白的表達來促進結腸的屏障功能[10]。 而在膿毒癥相關性腸損傷尤其是結腸損傷方面，有關丙酸鹽的研究尚未見報道。正常情況下，完整的腸屏障能保護機體免受損傷，然而當腸屏障損傷，細菌移位或有害物質進入體內，使得機體膿毒癥惡化[11]。因此，研究丙酸鹽在膿毒癥結腸損傷中的作用及其潛在作用機制有助于深入闡明兩者間的關系，為膿毒癥期結腸損傷的預防和治療提供新的途徑。

在本研究中，CLP誘導的膿毒癥大鼠模型死亡率很高，在前期的實驗中，我們發現，腹腔注射 200 mg/kg SP處理可顯著降低大鼠死亡率（P＜0.05），提示SP可保護大鼠免受CLP誘導的死亡。進一步的實驗中，根據HE染色結果提示，SP對結腸的組織結構具有保護作用，能減少中性粒細胞的浸潤，保護黏膜完整性，調節炎癥反應的細胞因子（包括促炎細胞因子和抗炎細胞因子）。促炎細胞因子與抗炎細胞因子之間不斷相互作用，引起細胞因子風暴[12]。早期抗炎細胞因子IL-6和TNF-α由巨噬細胞分泌并刺激免疫系統，已經有研究證明其在膿毒癥模型中顯著升高[13]。TGF-β是抗炎細胞因子的一種，研究發現，抑制TGF-β有助于保護膿毒癥大鼠模型[14-15]。我們的實驗結果顯示，SP能顯著降低膿毒癥大鼠結腸組織中的IL-6、TNF-α和TGF-β水平。與之前的報道一致，即丙酸鹽可以顯著減少DSS誘導的結腸炎模型中的炎癥細胞因子[8]。因此，我們推測，SP通過抑制IL-6、TNF-α和TGF-β等炎癥細胞因子，阻止細胞因子風暴，改善膿毒癥結腸組織的炎癥反應。

腸上皮細胞之間的緊密連接是腸黏膜屏障中不可或缺的一部分，在維持腸屏障結構和功能方面起著重要作用。有研究表明，由于腸屏障受損，水電解質吸收失衡，claudin-1基因敲除鼠不能存活24 h[16]。 腸屏障損傷被認為是膿毒癥多器官功能障礙綜合征的病因之一[17]。腸道病原體常常通過改變緊密連接破壞腸屏障。本研究結果顯示，CLP+SP組的claudin-1和occludin的蛋白表達比CLP組顯著增加，2組差異具有統計學意義（P＜0.05）。從免疫組化染色結果來看，CLP+SP組結腸組織比起CLP組，呈棕色的緊密連接蛋白顏色更深，且分布更為連續密集。這表明SP通過增加緊密連接蛋白的表達對膿毒癥大鼠結腸屏障起保護作用。

圖5 各組大鼠結腸組織occludin、claudin-1蛋白表達情況（免疫組化法）

圖6 各組大鼠結腸組織NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表達情況

膿毒癥早期，適度的炎癥反應可以抵擋外來病原體從而避免機體組織進一步的損傷。然而，過度的炎癥反應會導致機體的臟器損傷和功能障礙。NLRP3炎性小體被認為可能會參與膿毒癥的炎癥級聯放大，對于膿毒癥患者的病情嚴重程度的預測，具有一定價值[18-19]。有研究認為NLRP3炎性小體在維持腸道內環境穩定中發揮重要作用[20]。NLRP3被激活后，參與腸道的炎癥反應，分泌IL-18和IL-1β，募集炎性細胞浸潤，減弱腸道黏膜屏障功能。本實驗結果顯示，SP可以減少NLRP3炎性小體活化相關蛋白表達，表明SP可能通過抑制NLRP3炎性小體減少膿毒癥結腸損傷。由于可用于動物實驗的NLRP3激動劑的不足，在接下來的實驗中，若能在分組上再添上CLP+SP+NLRP3激動劑組，則能更進一步證明SP抑制NLRP3炎性小體。

圖7 各組大鼠結腸組織caspase-1、NLRP3蛋白表達情況（免疫組化法）

綜上所述，SP可能通過抑制NLRP3炎性小體的活化減少CLP誘導的膿毒癥大鼠中結腸組織的炎癥和損傷，從而發揮對膿毒癥大鼠結腸組織的保護作用。此外，SP還能顯著提高膿毒癥大鼠的存活率。