具有抗細菌黏附和殺菌雙重功能的(HA/CHI-Van)5涂層的制備

廖鑫，黃義星

（溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院 骨科，浙江 溫州 325027）

內植入物感染是骨科的嚴重并發癥之一，給患者和社會帶來了嚴重的負擔。據報道，在美國每年因植入物感染導致死亡的人數高達5.5萬，用于治療植入物感染的費用超過一千萬美元[1]。傳統的臨床治療方法為全身應用抗生素。全身用藥時，可能會因病灶處血液循環障礙和瘢痕組織的影響導致患處的抗生素濃度無法達到有效水平，從而影響抗感染效果，還會帶來嚴重的全身不良反應。而且，細菌會產生表型改變和代謝，從而對抗生素產生抵抗。本研究采用層層自組裝的技術制備(HA/CHIVan)5多層膜結構，用于預防骨科內植入物感染的發生。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料和試劑：透明質酸（hyaluronic acid，HA）購自濟南福瑞達生物化工有限公司；殼聚糖（chitosan，CHI）購自上海阿拉丁工業公司；萬古霉素（Vancomycin，Van）、LB肉湯購自大連美倫生物技術有限公司；蘇木素伊紅染色液、PBS緩沖液、硅片、無水乙醇、聚乙烯亞胺（polyethyleneimine，PEI）購自上海碧云天生物技術有限公司；血平板購自廣州環凱微生物科技有限公司；24孔板細胞爬片購自上海聯碩生物科技有限公司；金黃色葡萄球菌、大腸桿菌購自上海艾研生物科技有限公司；Live/Dead試劑盒購自美國Thermo公司；SD大鼠購自溫州醫科大學實驗動物中心，動物許可證號：SYXK（浙）2019-0009；克氏針購自上海開為醫藥科技有限公司；EDTA脫鈣液購自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.1.2 實驗儀器：zeta電位儀購自英國馬爾文儀器有限公司；SW-CJ醫用型超凈工作臺、孵箱、倒置熒光顯微鏡購自上海躍進醫療器械公司；掃描電鏡（SEM）購自天美（中國）科學儀器有限公司；醫用診斷X光機購自北京普朗新技術有限公司；小動物活體microCT影像系統購自上海珀金埃爾默企業管理有限公司；硬組織切片機購自西安藍茗醫療科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 多層膜的制備：將PEI溶解在去離子水中，并攪拌過夜至2 mg/mL的濃度。制備濃度為0.005 mol/L 的醋酸溶液，并且將HA溶解于上述溶液中至終濃度為1 mg/mL。用相同的方法制備相同濃度的CHI溶液。然后，將Van溶解在上述CHI溶液中，攪拌過夜至終濃度為1 mg/mL(CHI-Van)。將基材（硅片、24孔板玻璃片、克氏針）放入250 mL燒杯中并加入100 mL無水乙醇，超聲處理10 min后，用去離子水清洗，以此為一個循環，反復清洗3遍后用高純氮將洗凈的基材吹干。將洗凈的基材放入提前配制的2 mg/mL 聚乙烯亞胺溶液中浸泡2 h后取出，用高純氮吹干，使基材的表面帶有穩定的正電荷。然后將它們浸入HA溶液中15 min，隨后用乙酸緩沖液漂洗，漂洗后氮氣吹干。然后根據不同的組裝目的，將上述材料浸泡在CHI或CHI-Van溶液中15 min，然后進行相同的漂洗和干燥程序，以此為一個雙層。重復該組裝過程，最后獲得(HA/CHI)n和(HA/CHI-Van)n（n代表組成的雙層數）多層膜結構。

1.2.2 zeta電位的測定：取ps懸濁液1 mL置于 1.5 mL離心管中，離心機8 000 r/min下離心5 min，去除上清液，加入1 mL PEI，常溫下反應15 min，吹打混勻，吸取100 μL加入1 mL PBS中測量zeta電位，將離心管內剩余懸濁液離心機8 000 r/min下離心5 min，去除上清液，加入1 mL HA，常溫下反應15 min，吹打混勻，吸取100 μL加入1 mL PBS中測量zeta電位，標記為(HA/CHI-Van)0.5。將離心管內剩余懸濁液離心機8 000 r/min下離心5 min，去除上清液，加入1 mL CHI-Van，常溫下反應15 min，吹打混勻，吸取100 μL加入1 mL PBS中測量zeta電位，記為(HA/CHI-Van)1。以此類推，連續測量5雙層，記錄數據。

1.2.3 活細菌染色實驗：實驗中使用LIVE/DEAD BacLight細菌活力試劑盒測定細菌活力。其中SYTO9能對具有完整細胞膜的活細菌進行染色，形成綠色熒光。該實驗分成空白組和(HA/CHI)5組，取無菌24孔板細胞培養板，空白組放入未修飾空白玻璃片，(HA/CHI)5組放入經(HA/CHI)5多層膜修飾的玻璃片，每組設置5個平行樣本，并做好標記。每孔中加入1 mL金黃色葡萄球菌（102CFU/mL，LB肉湯稀釋），將24孔板放入37 ℃恒溫孵箱中培養5 h。取出配制好的混合染料在室溫下解凍并打開熒光顯微鏡預熱30 min。取出24孔板，將細菌液吸出，加入500 μL超純水，輕輕搖晃，反復清洗3次。加入200 μL配制的混合染料，避光培養15 min后，吸出染料，再用超純水清洗3遍，最后在避光條件下在熒光顯微鏡下觀察。將金黃色葡萄球菌換成大腸桿菌，實驗條件不變，重復上述實驗步驟。

1.2.4 越獄實驗：將24 孔板玻璃片分成空白組、(HA/CHI)5組和(HA/CHI-Van)5組。空白組放入未修飾空白玻璃片，(HA/CHI)5組放入經(HA/CHI)5多層膜修飾的玻璃片，(HA/CHI-Van)5組放入經(HA/CHIVan)5多層膜修飾的玻璃片。收集對數生長階段的新鮮金黃色葡萄球菌（濃度108CFU/mL）。將各組玻璃片分別置于瓊脂平板中間，吸取20 μL上述濃度菌液滴于玻璃片中間，37 ℃培養48 h，觀察細菌生長狀況。實驗條件不變，用大腸桿菌重復上述實 驗。

1.2.5 金黃色葡萄球菌的場發射掃描電子顯微鏡（FE-SEM）：準備未修飾空白硅片、(HA/CHI)5和 (HA/CHI-Van)5多層膜修飾的硅片各3片，分組如上。分別浸入1 mL金黃色葡萄球菌（102CFU/mL，LB肉湯稀釋）懸浮液中，并在37 ℃下孵育8 h以使細菌生長，將樣品用無菌0.9%氯化鈉溶液洗滌3次以除去未附著的細菌，然后用2.5%戊二醛固定12 h，通過一系列分級乙醇溶液（50%、70%、90%、100%）脫水，時間分別為2、1、1、2 h。將所有樣品烘干后，使用FE-SEM觀察。

1.2.6 動物造模：本實驗所用SD大鼠是由溫州醫科大學實驗動物中心提供，均為雄鼠，健康狀況良好，2月齡，體質量（200±20）g。適應性飼養結束后，選擇精神狀態好，體質量接近的大鼠，隨機分成3組，每組8只，水合氯醛麻醉后，用剃須刀剃毛，碘伏消毒，手術暴露脛骨平臺，在此過程中盡可能保留重要神經、血管、韌帶組織。用0.8 mm克氏鉆頭垂直鉆入髓腔，鉆孔與脛骨平臺垂直，用無菌注射器吸出少量骨髓。將克氏針放入鉆孔內，分為空白組、(HA/CHI-Van)5組、假手術組，前2組從鉆孔中注射10 μL金黃色葡萄球菌，假手術組不注射細菌，空白組和假手術組都采用沒有涂層的克氏針， (HA/CHI-Van)5組采用表面有(HA/CHI-Van)5多層膜修飾的克氏針。然后用骨蠟封閉鉆孔，逐層縫合，手術全過程注意無菌操作。待大鼠蘇醒后，隔離飼養，給予充足飼料和水，保持飼養環境干燥，每天觀察。

1.2.7 大鼠傷口觀察和骨髓腔細菌檢查：手術6周后處死所有大鼠，剪開傷口皮膚，詳細檢查創口情況，然后打開左下肢脛骨骨髓腔，用無菌注射器吸取少量骨髓液混合物，用LB肉湯進行培養，培養 24 h后在血平板培養基上涂板培養。

1.2.8 X線檢查和評分：處死后馬上取大鼠大腿進行X光片檢查，設置條件：電壓45 kV，電流250 mA， 曝光時間0.2 s。主要觀察大鼠大腿骨質破壞，溶骨和周圍組織情況。接著我們邀請了3位骨科副主任醫師對X線檢查結果進行評估。根據脛骨感染的X射影像學檢查，評估了脛骨感染的嚴重程度[2]。評價區域：脛骨平臺和脛骨干。

1.2.9 CT檢查：X光片檢查結束后，剔除骨上附著的軟組織，立刻進行CT檢查。我們將距離克氏針表面半徑為0.1 mm的環作為感興趣區（VOL）。分析左脛骨干髓端骨塊骨密度（bone mineral density，BMD）、骨小梁數量（Tb.N）、骨體積分數（BV/TV），并根據內置軟件作出3D圖和柱狀圖。

1.2.10 骨組織HE染色：處死大鼠后，取其左脛骨干髓端病變骨塊，用4%多聚甲醛溶液固定48 h，隨后用EDTA脫鈣液進行脫鈣，脫鈣完成后，進行乙醇梯度脫水，二甲苯透明，軟蠟浸泡1.5 h，硬蠟浸泡1.5 h，包埋機包埋，完成石蠟塊。將蠟塊進行組織切片并用HE染色。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS24.0軟件進行數據處理。計量資料以±s表示，多組比較用單采因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PBS中各組裝過程的zeta電位變化 當組裝第一層HA后，測得的電位為（-3.12±0.56）mV。繼續進行CHI-Van組裝后，電位變為（40.67±0.69）mV。觀察可見，隨著組裝過程的進行，每次組裝單層溶液后，測得的電位發生正負交替變化。見圖1。

圖1 在PBS溶液中不同組裝層數時的zeta電位

2.2 活細菌染色結果 結果顯示分別與金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌液接觸培養5 h后，空白組玻璃片表面均可以觀察到大量帶有綠色熒光的活細菌，但是(HA/CHI)5組玻璃片表面顯示綠色熒光的活細菌很少。見圖2。

2.3 金黃色葡萄球菌的越獄實驗和掃描電鏡結果 培養4 d后，越獄實驗顯示空白組玻璃片上的金黃色葡萄球菌大部分突破到環外，形成較大面積的菌落。(HA/CHI)5組的金黃色葡萄球菌也有部分突破到環外，形成較大面積的菌落，而由于萬古霉素對革蘭氏陽性菌具有強烈的殺菌作用，(HA/CHI-Van)5組的細菌在玻璃片中間被殺死，不能突破到環外。掃描電鏡結果顯示分別與金黃色葡萄球菌接觸培養8 h后，在空白組硅片表面和(HA/CHI)5組硅片均可以觀察到大量形狀為圓形的活細菌，但是(HA/CHIVan)5組硅片表面細菌卻很少。見圖3。

圖2 活細菌染色的熒光顯微鏡圖像（×20）

圖3 金黃色葡萄球菌的越獄實驗（a-c）和掃描電鏡結果（d-f，×4 000）

圖4 大鼠傷口觀察（a-c）及骨髓腔細菌檢查（d-e）

2.4 大鼠傷口觀察和骨髓腔細菌檢查 空白組傷口有黃白色的膿液溢出，表明細菌繁殖并且無法控制。(HA/CHI-Van)5組的傷口愈合良好，無化膿，無異常流液，與假手術組相似。擴增骨髓液并在血平板培養基上培養后，我們發現空白組中出現了大量細菌，而且單個菌落呈金黃色，大而凸，圓形且不透明，表面光滑，周圍有溶血環。這特異性證明傷口表面的細菌是金黃色葡萄球菌。但是在(HA/CHIVan)5組中，無法培養出細菌。假手術組未注射細 菌，因此未進行細菌檢查。見圖4。

2.5 X線檢查和評分 從X線片檢查結果可以看出，空白組的脛骨平臺顯示不清，骨質破壞嚴重，出現溶骨性病變。假手術組顯示出正常的骨形態， (HA/CHI-Van)5組未能發現骨病變情況。為了量化骨感染的程度，遵循骨感染放射學評估系統，計算后可以發現空白組的得分為12.30±0.86， (HA/CHI-Van)5組的得分為0.70±0.47，假手術組的得分為0.30±0.47。X線得分越低，說明骨形態越好。(HA/CHI-Van)5組X線得分方面優于空白組（P＜0.05），且非常接近假手術組（P＞0.05）。見圖5。

圖5 X線檢查結果

2.6 CT檢查 我們進一步使用Micro-CT對植入6周后獲得的骨標本進行成像評估（見圖6d-f），并基于內置軟件制作了3D圖（見圖6a-c）。空白組中的大鼠橋接和再生的速度最慢，圖中的黃色部分代表新骨骼，6周后僅形成少量新骨骼。同樣，這組骨小梁微結構也最稀疏。假手術組新骨再生良好，并顯示出良好的骨小梁微結構，(HA/CHI-Van)5組也表現良好。接著我們對各項數據進行定量分析，空白組的BMD數值為（0.012±0.008）g/cm3，(HA/CHI-Van)5組為（0.047±0.004）g/cm3，假手術組為（0.058± 0.017）g/cm3。空白組的骨小梁數量為（1.238± 0.088）mm-1，(HA/CHI-Van)5組為（1.490±0.135）mm-1， 假手術組為（1.495±0.117）mm-1。空白組的骨體積分數為（20.082±1.236）%，(HA/CHI-Van)5組為（31.188±2.216）%，假手術組為（31.955±4.513）%。(HA/CHI-Van)5組在BMD、骨小梁數量和骨體積分數方面均優于空白組（均P＜0.05），并且非常接近假手術組（均P＞0.05）。見圖6。

圖6 克氏針周圍新骨形成情況

2.7 骨組織HE染色 空白組的骨組織受到嚴重感染，形成膿腫，骨小梁形態消失，大多數骨髓細胞廣泛壞死，炎性細胞核染成黑色，并且炎性細胞廣泛分布。(HA/CHI-Van)5組和假手術組的骨組織結構正常，炎癥細胞不明顯，骨小梁清晰可見。見圖7。

圖7 骨組織HE染色（×200）

3 討論

隨著社會的發展和交通運輸的增加，由高能暴力（如車禍和機械設備）引起的四肢骨折越來越多。臨床上，通常使用外固定或內固定治療。外固定支架不易操作，患者佩戴不舒服，價格昂貴，更重要的是，它容易造成骨折畸形，使用骨內植入物則沒有這種問題。然而，內植入物感染是骨科手術失敗的重要原因，這增加了患者的經濟負擔并在嚴重情況下導致殘疾。盡管采取了預防植入物感染的措施，但仍有大約5%～10%的內植入物患者被感染[2-5]。 在臨床治療中，盡管使用了延遲手術和長期的抗生素治療，但古斯蒂洛-安德森（Gustilo-Anderson）III型骨折的感染率仍然很高，甚至達到52%，而且當再次植入骨植入物時，這些殘留的細菌會在植入物的表面上繁殖，從而導致感染的復發[6]。

研究人員首先探討了植入物感染的原因。在內部植入物材料的表面張力和靜電作用下，細菌黏附并在植入物表面繁殖[7]。附著在植入物表面的細菌開始分泌細胞外基質和分裂增生[8]。針對上述骨植入物感染的原因，研究人員在骨科抗菌涂層的改性方面取得了兩個方面的重大進展：①植入物的表面裝有抑菌物質涂層以抑制粘連植入物表面的細菌污染，也稱為被動抑菌；②在骨植入物的表面上修飾殺菌材料涂層，當細菌與植入物的表面接觸時直接殺死細菌，這也稱為主動殺菌[9-11]。這為實驗設計提供了一個思路，可以制備出具有抗細菌黏附和殺菌功能的多層膜結構。

層層自組裝技術于20世紀90年代初期被正式提出[12]。層層自組裝技術通過改變自組裝多層膜的層數和聚電解質的類型，可以容易地控制多層膜的物理和化學性質。各種生物分子（如蛋白質、酶、藥物和納米顆粒）可以一層一層地沉積而不會失去其生物學功能[13]。目前，它們已被用于調節細菌黏附，制造陽離子涂料等，層層自組裝技術的應用前景在醫用領域方面非常廣闊。骨科感染最常見的細菌是金黃色葡萄球菌[14]，萬古霉素是一種糖肽抗菌劑，對侵襲性的革蘭氏陽性細菌有很強的作用，被認為是治療金黃色葡萄球菌的首選藥物。CHI是生物學上僅次于蛋白質膠原的最重要的動物結構材料，其獨特的化學結構，活性羥基和氨基形成具有高電子密度的線性聚電解質鏈，使其表面帶正電并能夠吸引陰離子聚集體。CHI可以以1%的質量分數溶于乙酸溶液中，它具有良好的生物相容性，沒有毒性和不良反應，可以在體內被生物降解[15-16]。研究表明，帶正電的CHI分子與帶負電的微生物細胞膜之間的相互作用導致細胞膜的破壞，最終有助于殺菌作用[16]。CHI由于其固有的抗菌特性已被用作預防感染的抗菌劑。然而，在骨組織工程中，單獨使用CHI作為骨移植材料并不罕見，主要是將CHI復合到其他材料中起特定作用，例如復合支架材料形式，載體形式，涂層形式等[17]。HA是一種線性大分子黏多糖，廣泛分布于人和動物中，具有廣泛的臨床療效。例如，在關節疾病的治療中，可以添加HA以恢復滑液的潤滑功能并促進關節修復[18]。因此，該實驗使用可靠的材料來制備多層膜，以避免不良反應。

本研究通過層層自組裝方法制備(HA/CHI-Van)n多層膜結構。首先，通過物理吸附技術使基材表面胺化，然后使用帶負電的HA和帶正電的CHI-Van之間的靜電相互作用來制備(HA/CHI-Van)n雜化涂層。由于HA溶液本身具有負電荷，CHI溶液具有正電荷，隨著組裝過程的進行，每次應用單層時，測得的電位正負交替變化，這表明通過靜電相互作用成功完成了聚合物層的組裝。而且該合成方法簡便易行，可實現批量生產。

本研究采用活細菌染色實驗，證明在沒有抗生素的情況下，CHI對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都具有一定的抗黏附作用，這是因為CHI可與細菌細胞膜發生相互反應而導致細菌溶解死亡。越獄實驗和FE-SEM實驗證明，當細菌濃度較大時，(HA/CHIVan)n多層膜結構對金黃色葡萄球菌依然具有良好的殺菌作用。本研究還進行了大量的動物實驗來檢驗(HA/CHI-Van)n多層膜的抗菌性能。X線影像學檢查發現，空白組脛骨平臺處出現骨質溶解，出現嚴重的骨膜反應。有意思的是，(HA/CHI-Van)n組的骨形態完好，沒有發現病變，而且非常接近假手術組。本研究又進行了CT檢查。BMD是骨質量的一個重要標志，反映骨質疏松程度，預測骨折危險性的重要依據。骨小梁數量用于描述骨小梁結構形態，解釋骨量變化，其變化可影響骨量，在寬度一定的條件下，數量越多，骨量越多。骨體積分數表示骨組織體積與組織體積比值，可直接反映骨量多少。通過檢測我們發現(HA/CHI-Van)n組的上述數據均優于空白組，而研究表明骨骼再生需要更嚴格的無菌條件，并且細菌定植會嚴重阻礙骨骼再生過程[19]，證明(HA/CHI-Van)n組具有良好的抗感染效果，而接近假手術組則說明(HA/CHI-Van)n多層膜結構具有良好的生物相容性。各組骨組織切片結果也符合上述規律。因此，該多層膜結構兼有抗細菌黏附和殺菌的功能，同時具有良好的生物相容性，是一種很有潛力的預防骨植入物感染醫用材料。