一種改良的去細胞皮瓣制備方法

馮雨露，周樂斌，2，薛向陽，梅勁，3

（1.溫州醫科大學 基礎醫學院 解剖教研室，浙江 溫州 325035；2.樂清市人民醫院 急診科，浙江 溫州 325600；3.寧波市第一醫院 科研中心，浙江 寧波 315000）

隨著基于以肝、心、肺、腎和神經[1-5]等重要器官的去細胞器官為支架在體外重建獲得階段性進展，去細胞皮瓣也逐漸吸引修復重建外科領域 研究者們的注意[6]。然而，皮瓣為不均質組織，常規去細胞的過程存在耗時長、流程復雜、條件苛刻等缺點，僅在制備階段就遇到了比實質器官更大的挑戰。本研究的目的是建立一個簡便可靠的去細胞方法來制備更具靈活性及臨床適用性的去細胞皮瓣。

1 材料和方法

1.1 去細胞皮瓣支架的制備 本研究嘗試了一種制作去細胞皮瓣的新方案，利用磁力攪拌器產生的不均勻力場來對沖非均質的皮瓣組織，以盡量保持皮瓣各組織層的完整性。取健康成年SD大鼠[溫州醫科大學實驗動物中心，許可證號：SYXK（浙）2019-0009；雌雄各10只，體質量300～320 g]，5%水合氯醛麻醉，沿腹正中線從下至上切開，對稱向背側剪開，保留3 cm×4 cm大小的皮瓣（圖1A方框處示意為取材部位），暴露股動靜脈。進行股動脈置管（24號留置針），結扎小動脈分支并剪開股靜脈后，注射0.05%的肝素生理鹽水約20 mL，至肉眼觀察到小血管變白。取下去血后的皮瓣，四角束縛于平皿中，表皮層朝向磁珠。平皿內含有0.05%肝素鈉生理鹽水，開啟磁力攪拌器低檔旋轉。然后依次灌注并震蕩0.05%肝素鈉溶液0.5 h，1% Triton 1～2 h，0.08% SDS 10～12 h，去離子水12 h。

1.2 去細胞皮瓣支架檢測

1.2.1 HE及DAPI染色：將皮瓣用OCT包埋后，切成7 μm厚的冰凍切片。0.02% PBS沖洗3次，每次 5 min。分別進行HE、DAPI染色后顯微鏡下觀察組織內結構和殘留細胞情況。

1.2.2 DNA總量的測量：將對照組皮瓣與去細胞皮瓣真空冷凍干燥24 h后，稱重，剪碎，按每0.1 g 組織添加1 mL DNA裂解液（100 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl、25 mmol/L pH 8.0 EDTA、500 mmol/L NaCl、1% SDS）及2 μL的蛋白酶K，55 ℃水浴過夜。12 000×g室溫離心10 min，取上清液加入等體積異丙醇混勻，冰浴10 min。再次離心，棄上清液， 42 ℃烘箱烘干后用加30 μL雙蒸水溶解DNA沉淀，于微量紫外分光光度計上測定吸光度，并結合重量換算DNA總含量。

1.2.3 殘留十二烷基硫酸鈉（SDS）的測量：SDS和亞甲基藍在酸性條件下產生藍色化合物。用二氯甲烷萃取藍色化合物后，通過比色法測定SDS含量。用蛋白酶K消化組織后，將上清液加到亞甲藍溶液（每100 mL亞甲基藍水溶液含250 mg亞甲基藍，50 g 無水硫酸鈉和10 mL濃硫酸）中，將混合物充分混合并用二氯甲烷萃取，棄去上層溶液。向每個試管中加入無水硫酸鈉，混合并離心。吸出試管中的澄清溶液，在651 nm的波長下測量吸光度。通過測量具有已知SDS濃度的8種溶液的吸光度產生SDS對照標準曲線，并計算結果。

1.2.4 掃描電鏡檢查：對照組及去細胞組皮瓣，分別切成1.0 mm3大小的組織塊，4 ℃ 2.5%戊二醛固定過夜，經PBS沖洗，鋨酸處理后固定，醋酸鈾染色后丙酮梯度脫水，環氧樹脂包埋劑浸透，包埋，制作超薄切片，掃描電鏡下觀察。

1.2.5 血管造影：根據文獻[7]進行操作。

1.3 皮下植入實驗

1.3.1 動物分組：共計32只2月齡SD大鼠（體質量約250 g），其中雌性16只，雄性16只。用5%水合氯醛麻醉后，固定，背部備皮，75%乙醇消毒，于脊背中線切開皮膚全層至深筋膜，打開四個間距約1 cm的小孔，分離皮下組織，制備皮下囊。對照組（16只大鼠，雌雄各半）皮下包埋4塊未去細胞皮瓣；實驗組（16只大鼠，雌雄各半）皮下包埋4塊去細胞皮瓣，所用皮瓣約1 cm×1 cm，包埋前將皮瓣于0.1%青鏈霉素抗生素浸泡24 h。術后給足糧食和水，不提供任何抗生素治療，定時觀察切口有無紅腫、感染。術后第1和第2周，實驗組和對照組分別隨機取8只大鼠中的移植物（雌雄各半）進行新生血管數目統計。

1.3.2 移植物血管計數：取術后第1周和第2周的移植物，制備厚度為10 μm的冠狀面冰凍切片并進行HE染色于光學顯微鏡下觀察。平均新生血管數目統計結果來自每張切片的10個高倍鏡（100倍放大）視野。

1.3.3 外周血淋巴細胞比例：術后第1、第3、第7和第14天，從大鼠尾靜脈采集外周血樣品，樣品在4 ℃下用肝素鈉抗凝血保存。血液樣品用紅細胞裂解緩沖液（R1010，北京索萊寶科技有限公司）并按照說明書處理后，將0.5 μL一抗（CD25-PEcy7，25-8484-80，CD4-FITC，11-0040-82，北京eBioscience公司）加入每個細胞管中。每管細胞在4 ℃下避光孵育1 h后，用PBS洗滌細胞3次，重懸細胞后使用BD FACSCanto II檢測。使用Flow Jo 6.0軟件進行數據分析。

1.4 統計學處理方法 采用SPSS17.0 統計軟件和Microsoft Excel進行統計學分析。計量資料用±s表示，2 組間比較用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 去細胞皮瓣支架大體觀察 制備完成的去細胞皮瓣具有白色不透明的外觀，見圖1B；腹主動脈血管造影顯示血管形態完整，分支清晰可見，見圖1C；掃描電鏡顯示較連續的蛋白纖維，見圖1D。

圖1 獲取的去細胞皮瓣表征

2.2 基因組DNA含量檢測 組織基因組DNA（gDNA）含量顯示實驗組DNA的總量比對照組顯著減少95%以上，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 DNA定量檢測結果

圖3 收獲的去細胞皮瓣核染色結果

圖4 SDS在651 nm處吸光度的標準曲線

2.3 組織學觀察 DAPI核染色觀察不到明顯的細胞核，HE染色僅可見紅色的細胞外基質，見圖3。

2.4 殘留SDS的檢測 根據該標準曲線換算得，去細胞皮瓣中殘余SDS約（28±4）mg/g，遠處于生物安全水平（133.3 mg/g[4]）之下，見圖4。

2.5 再生血管計數 包埋術后第1 周，實驗組支架材料與周圍組織界限清楚，包埋支架內部見少量炎性細胞浸潤，包埋支架邊緣可見少量新生血管長入；包埋術后第2周，支架組織內部見大量新生血管，無明顯炎性細胞浸潤。第1周和第2周，實驗組新生血管數明顯多于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），且炎癥反應明顯小于對照組。見圖5。

2.6 外周血中調節性T淋巴細胞的比例 術后第1天2組動物的調節性T淋巴細胞較標準對照均大幅下降；但實驗組在第3、第7和第14天調節性T淋巴細胞群比例均高于對照組（P＜0.05）。提示實驗組大鼠整體的免疫排斥反應比對照組弱。見圖6。

圖5 2組血管再生結果

圖6 去細胞皮瓣移植后外周血調節性T淋巴細胞比例變化

3 討論

與合成材料相比，去細胞支架不僅保留了較完整的原組織3D結構，還能保存大部分的膠原蛋白、黏連蛋白及纖連蛋白等，能夠調控細胞生長分化的細胞外基質成分[8]，本課題組此前報道證明，去細胞腎臟支架能有效促進腎臟的再生[4]。

隨著去細胞材料的廣泛應用，去細胞支架的制備方法也逐漸形成體系，包括灌注法和振蕩法[9-10]。 結合我們過去的嘗試以及對已發表文獻實驗結果的分析，我們發現單純使用灌注法進行皮瓣組織的去細胞難以獲得理想結果，原因可能是皮瓣屬于非均質組織，真皮部位疏松而表皮組織致密導致單純使用振蕩法進行去細胞很困難。因此我們對原有方法進行改進，使用磁力攪拌器進行輔助震蕩。方案改進后，皮瓣的表皮層可以受到垂直方向和水平方向的兩種力量，而同時真皮層只接受水平方向的一種力量，所以新方案可以在不影響去細胞速度的同時有效地去除皮膚和脂肪組織中的細胞和油脂成分。

通過該方法制備完成的去細胞皮瓣僅具有微量核碎片，不影響支架發揮其優秀的生物材料性質。血管造影術證實，去細胞皮瓣維持著主要的血管蒂和微循環網絡。這些結果表明，皮膚和脂肪組織ECM的天然3D結構和生化特性不僅在去細胞支架中得到了很好的維護，還能為細胞播種和組織工程提供地圖線索。

在動物實驗結果中，我們發現實驗組外周血調節性T淋巴細胞比例增高。結合文獻報道，移植術后該群細胞比例增高程度與宿主對移植物的排斥程度成反比關系[3]，所以使用該方法制備完成的去細胞皮瓣能產生低排斥的免疫環境。

使用磁力攪拌器輔助法制備的去細胞皮瓣，不僅能較完全地去除細胞核，還能保留完整的血管網絡。另外，皮下包埋結果證實該支架排斥反應低，生物相容性好，且能促進血管再生。本方法有助于為類似不均質組織的去細胞支架制備提供參考。