線粒體tRNATyrA5834G突變與Leber遺傳性視神經病變的相關性

胡翠芳，孔萬仲，陳孟權，梁敏，管敏鑫

（1.溫州醫科大學 檢驗醫學院 生命科學學院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫科大學附屬第一醫院 醫學檢驗中心，浙江 溫州 325015）

Leber遺傳性視神經病變（Leber’s hereditary optic neuropathy，LHON）是一種線粒體遺傳性視神經疾病，主要累及視網膜、鞏膜篩板前部視乳頭黃斑束纖維，導致雙眼同時或先后出現無痛性視力減退，視網膜神經節細胞退行性病變，同時可伴有中心視野缺失及色覺障礙[1-2]，發病人群多為青壯年男性，發病年齡多見于17～30歲。研究表明LHON家系中50%以上由ND1 G3460A、ND4 G11778A和ND6 T14484C這3個原發突變位點引起[3-4]。近年來，除上述3 個原發性突變位點外，相繼發現線粒體ND1T3394C、ND1T3866C、tRNAMetA4435G、 ND4G11696A、ND6T14502C、tRNAGluA14693G、tRNAThrA15951G等突變也可能與LHON的致病相 關[5-14]。本研究主要對2個典型LHON患者及其家系進行詳細眼科相關檢查、線粒體全基因組分析、種系發生學分析及單體型分析，為進一步闡明LHON的發病機制提供依據。

1 對象和方法

1.1 對象 對來自浙江溫州地區2個典型LHON家系進行家系調查，編號WZ1007和WZ1035，如圖1所示。對2個先證者及家系成員進一步詢問，并進行詳細的眼科相關檢查，完善相關臨床病史資料。同時選取104例漢族健康受試者作為正常對照，采集先證者家系和正常對照人群的EDTA-K2抗凝靜脈血 5 mL。本研究經溫州醫科大學倫理委員會批準，所有參與對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 眼科學檢查：對2個家系的先證者及其家系中其他成員進行臨床眼科檢查，包括標準對數視力表檢測視力、眼底照相拍片（美國VOLK D90）、俞自萍色覺圖檢查、電生理儀檢測視覺誘發電位（visual evoked potential，VEP）、眼科光學相干斷層掃描技術（OCT檢查儀，德國Heidelberg公司）等檢查。雙眼視力損傷程度參照WHO標準，正常＞0.3；0.1≤輕度＜0.3；0.05≤中度＜0.1；0.02≤重度＜0.05；極重度＜0.02。

1.2.2 基因組DNA提?。菏褂猛庵苎狣NA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司），提取2個家系先證者及成員和104例正常對照的EDTA-K2抗凝靜脈血的全基因組DNA，NanoDrop1000測定濃度，-20 ℃保存備用。

1.2.3 PCR擴增及測序分析：以先證者及家系成員和正常對照的基因組DNA為模板，針對G11778A、G3460A和T14484C這3個原發突變位點所在基因片段進行引物設計，經PCR擴增及產物純化后，用自動測序儀進行測序[15]。同時，采用二代測序法對先證者及家系成員和正常對照的線粒體基因組進行全序列測序，進一步確定線粒體基因組的突變位點，使用Snapgene等軟件對測序結果與劍橋參考序列[16-17]進行比對分析。

1.2.4 種系發生學分析和單體型分析：根據 GenBank選取人（Homo sapiens）、牛（Bostaurus）、小鼠（Mus musculus）、非洲爪蟾（Xenopus laevis）等17 個不同物種，對線粒體序列進行種系發生學分析，計算mtDNA突變的保守系數，進行保守性分 析[1]。根據東亞線粒體單體型進化樹對線粒體DNA突變的多態性位點進行單體型分型。

2 結果

2.1 臨床資料 2個LHON家系圖見圖1。WZ1007家系先證者（III-2）17歲時因雙眼視力同時下降就診，經檢查雙眼視力輕度損失，色覺正常；視野檢查提示視野中心出現暗點；眼底拍照如圖2所示，表現為雙眼視盤偏淡，視乳頭周圍毛細血管輕微擴張；VEP檢查表現為P100峰潛時延長，幅值下降；OCT檢查無明顯變化（見圖3）。WZ1035家系先證者（III-2）20歲時因視力驟降就診，雙眼視力中度損失，色覺正常；視野檢查提示雙眼視野呈現向心性縮小，中心出現暗點；眼底拍照提示杯盤比增大；VEP檢查表現為P100峰潛時延長，幅值下降；OCT檢查提示鼻側和顳側象限視網膜神經纖維層（retinal nerve fiber layer，RNFL）變??；其母視力重度損失，但未作其他眼科相關檢查。2個先證者經臨床檢查均未發現其他疾病，無其他不良嗜好和外傷史。除WZ1035-II-4外，2個家系其他成員視力均正常。

圖1 2個LHON家系圖

2.2 線粒體基因組分析 PCR和測序分析結果顯示2個家系所有成員和正常對照均未發現G3460A、G11778A和T14484C這3個原發突變位點。通過二代測序法對2個先證者進行線粒體全序列分析，結果如表1所示，2個先證者攜帶36個線粒體基因突變位點，分別位于D-loop區7個，12S rRNA 2個，16S rRNA2個，tRNA 1個，蛋白編碼區24個，包含10個錯義突變和14個同義突變，其中10個錯義突變為：ND1基因G4084A（Val260Leu），MT-ND2基因G5460A（Ala331Thr），MT-CO2基因G7853A（Val90Ile），ATP6基因A8701G（Thr59AlaA）和A8860G（Thr112Ala）， MT-ND3基因A10398G（Thr114Ala），MT-ND4基因G11696A（Val313Ile），MT-ND5基因T12811C（Tyr159His），MT-Cytb基因C14766T（Thr7Ile）和A15326G（Thr194Ala），其中ND4 G11696A已報道是與LHON相關的線粒體突變位點，其余變異位點通過對人、牛、小鼠、非洲爪蟾4個不同物種進行保守性分析，發現2個先證者同時攜帶的變異位點中A5834G和T12811C變異位點在進化上保守，通過進一步對17個不同物種mtDNA進行保守性分析，發現A5834G保守系數為87.5%（見圖4），除T12811C在正常人突變頻率較高外，其余變異位點均不保守，且均已報道可能與LHON的發病無關。同時2個家系中其他母系成員均攜帶A5834G突變，而104例正常對照和家系中非母系成員則不攜帶A5834G突變。根據東亞線粒體單體型系統進化樹分析，這2個家系的mtDNA序列均屬于東亞單體型M7b，已有研究證實M7b會加重LHON的臨床表現[18]。

圖2 2例先證者的眼底表現

圖3 2例先證者的OCT檢查結果

3 討論

本研究中2 個家系的先證者均具有典型LHON 臨床表現，2個先證者年齡分別為17歲和20歲，符合LHON好發于青壯年特點，除表現為視力損害外，未發現其他明顯臨床表現，所有研究對象經PCR擴增測序均未發現G11778A、G3460A和T14484C這3個原發突變位點。本研究對這2個家系進行詳細的臨床評估及分子遺傳學特征分析，通過對線粒體基因組全序列分析，發現這2個家系母系成員均攜帶tRNATyrA5834G突變位點，該突變影響mtDNA tRNATyr基因T-莖中的第65 位堿基，如圖5 所示線粒體tRNATyr的二級結構示意圖，T-莖可作為線粒體DNA重鏈和輕鏈的啟動子，編碼多種對tRNA結構穩定性起重要作用的功能蛋白[19]。tRNA作為翻譯核心角色，在核酸信息水平和蛋白質功能水平間發揮重要作用，具有高度保守的二級和三級結構[20]，tRNA轉錄后修飾的密度在所有RNA中最高，主要集中在反密碼子環和tRNA核心區域，從標記有tRNA修飾數據的釀酒酵母（S.cerevisiae）tRNATyr晶體結構可知（見圖6），其中標記紅色的D-loop和T-loop兩個主要區域的堿基通過彼此間相互作用來穩定第三折疊結構，這些修飾位點的改變可能會導致tRNA結構發生較大的重排或局部微調[20-21]。目前已有報道證明參與編碼tRNA且位于tRNA T莖環處的A14692G、A14693G、C12191T突變位點是LHON相關的線粒體突變位點[22-23]。線粒體G5834A突變可能會影響tRNATyr前體的合成和加工過程，引起tRNATyr的空間結構和功能穩定性改變，tRNA轉運代謝功能障礙，線粒體相關蛋白合成和代謝功能障礙，ATP生成減少等一系列反應，最終導致高能量需求的視網膜視神經發生病變，引發LHON。

表1 2個先證者線粒體DNA全序列突變位點分析

圖4 通過cluster程序對不同物種中的線粒體tRNATyr基因進行序列比對顯示整個物種中5 834位G核苷酸的保守性

圖5 線粒體tRNATyrA5834G的二級結構示意圖

圖6 含堿基修飾頻率的tRNA結構彩圖

報道中常用于突變位點致病性的評估標準為：①出現在＜1%的對照中；②進化保護（保守性）；③潛在的結構和功能變更[24]。本研究的正常對照中均未發現攜帶tRNATyrA5834G突變位點，該突變位點在17種生物中高度保守，且可能存在結構和功能的改變，符合線粒體突變的致病標準。同時，已有研究證實線粒體單體型與LHON的外顯率和致病性嚴重程度相關，HUDSON等[25]研究表明線粒體單體型J是歐洲LHON家系的遺傳易感型，YU等[26]發現單體型F存在T14484C突變加重LHON嚴重程度的現象，表明某些單體型可對LHON起有害或保護作用，JI等[27]在中國人群中發現M7b2單體型可增加攜帶有G11778A家系的患病風險，本研究中2個先證者均屬于東亞M7b單體型，提示攜帶A5834G的M7b單體型可能對LHON臨床表型存在影響。2個先證者均具有典型LHON臨床表現，2個先證者發病年齡分別為17歲和20歲，平均18.5歲，與冀延春等[28]報道的T12338C突變、QU等[29]報道的T14484C突變以及ZHOU等[30]報道的G11696A突變LHON家系（平均18.5歲、18.4歲）接近，也符合LHON好發于20歲左右青壯年這一特點，A5834G突變的這2個家系外顯率分別為8.3%、7.7%，與已經報道的G11778A、G3460A、T14484C這3個原發性突變位點的家系類似，且與T12338C、A14693G、T3394C突變的家系外顯率相近，這表明線粒體tRNATyrA5834G突變可能在LHON中發揮協同作用，是與LHON相關的mtDNA突變位點，同時低外顯率提示可能存在其他因素（核修飾基因、環境等）影響這2個家系的表型表達。