養陰活血解毒方對實驗大鼠肝組織相關標志性蛋白表達的影響

梁小文，張鈺斌，馬超，謝鴻恩，陳啟紅，劉中景

(粵北第二人民醫院感染科，廣東 韶關 512028)

肝硬化及其并發癥是當下臨床醫生所面對的主要肝病人群，也是臨床治療難題，現代醫學尚缺乏有效治療藥物，西藥抗病毒治療只能在一定程度上控制病情，仍然不能阻止肝硬化的反復發病甚至逆轉肝硬化[1]。近年來，大量的臨床與基礎研究工作業已證實，中醫中藥在抗肝硬化方面有著明顯治療優勢[2],其機理主要表現在拮抗肝星狀細胞(HSC)的活化；抑制活化的HSC細胞增殖與膠原生成；調節肝組織基質金屬蛋白酶活性，逆轉肝竇毛細血管化等等[3]。一致認為“扶正化瘀”為中醫治療肝硬化的基本原則[4]，而滋養肝腎活血化瘀中藥處方具有明顯的抗肝纖維化效果[5]。

我們在長期臨床實踐的基礎上總結發現，肝腎陰虛、瘀血濕熱是肝硬化多見中醫證型之一，滋養肝腎、活血解毒治療可以取得較好的臨床效果，本研究在長期臨床實踐的基礎上觀察養陰活血解毒方對實驗大鼠肝組織相關標志性蛋白表達的影響，探討其抗肝纖維化的作用機理。

1 實驗材料

1.1 動物

雄性SD大鼠共60只，體質量150～200 g，由青島市疾病控制中心動物實驗中心提供(合格證號：sexk20180020)。

1.2 藥物

中藥：由粵北第二人民醫院中藥房提供，資格中藥師鑒定真偽。養陰活血解毒方：柴胡15 g，香附12 g，川芎12 g，丹參15 g，桃仁12 g，紅花12 g，白芍15 g，熟地黃15 g，麥冬15 g，枸杞15 g，茵陳15 g，白花蛇舌草15 g。以上藥物先冷水浸泡約1 h，武火煮沸后改用文火煎至40 min，二次復煎去渣取汁，合和混均并水浴濃縮至濃度為0.75 kg/L，制成水煎夜放置冰箱備用。

西藥：秋水仙堿(浙江華海藥業股份有限公司，國藥準字H20030016)，粵北第二人民醫院西藥房提供。換算成大鼠用藥劑量，每次用藥劑量為成人每日用藥劑量(1 mg/60 kg)的20倍，即0.25 mg/kg，蒸餾水調制，藥液濃度為0.025 g/L，冰箱貯備。

2 實驗方法

2.1 造模

按照相關文獻[6]，CCl4與花生油二者均購于廣州市光明化學股份有限公司。兩者以4∶6比例配成40%制劑，除空白對照組外，其余各組大鼠均執行CCl4制劑腹腔注射。首次以0.5 mL/100 g體質量劑量，后繼續以0.3 mL/100 g體質量劑量注射，每周2次，約第4周末大鼠中期肝纖維化形成，繼續維持注射至第12周。實驗結束后以戊巴比妥鈉0.5 g加生理鹽水腹腔麻醉注射，打開腹腔，摘取肝組織-20 ℃保存，做相關指標檢測。

2.2 給藥及分組

60只雄性SD大鼠隨機分為4組，即空白組、模型組、西藥組和中藥組，每組15只。于造模后第4周末大鼠中期肝纖維化形成[6]開始灌胃給藥。空白組和模型組以生理鹽水2mL每天2次；西藥組以秋水仙堿制劑按大鼠0.1 mg/kg體質量劑量給藥；中藥組以中藥制劑2 mL每天2次給藥。共給藥8周。

2.3 檢測方法

肝組織羥脯氨酸含量測定采用比色法，參考相關文獻[7]。主要試劑：羥脯氨酸標準液，枸櫞酸鈉緩沖液，二甲氨基苯甲醛液，Tris緩沖液等(武漢博歐特生物科技有限公司提供)；胰蛋白酶(廣州輝駿生物科技有限公司提供)。取10 g肝組織，加30 mLTris緩沖液冰浴500 r/min勻漿，加入2.5%胰蛋白酶2 mL 37 ℃水浴20 min，低溫離心固液分離。繪制標準曲線，橫坐標為羥脯氨酸濃度，縱坐標為吸光度，樣品于60 ℃水浴20 min冷卻后在560 nm處測吸光度。

肝組織α-SMA、Smad3檢測采用免疫組化法(SP法)。取大鼠肝組織約1 cm×1 cm甲醛液固定，石蠟包埋切片，免疫組化染色。切片經梯度酒精脫水，中性樹膠封固。采用HPIAS-2000型圖象分析軟件進行定量分析，每張切片選取10個視野測定其陽性細胞的灰度值與染色陽性面積。主要試劑：鼠抗人α-SMA購于深圳子科生物科技有限公司；羊抗大鼠Smad3購于上海樊克生物科技有限公司；免疫組化S-P試劑盒及其DAB顯色劑購于武漢博歐特生物科技有限公司；免疫PS試劑盒購于武漢博歐特生物科技有限公司。

2.4 統計學分析

3 結果

3.1 對大鼠肝組織Hyp表達的影響

見表1。與空白大鼠組比較，造模后大鼠肝組織Hyp含量表達明顯，差異有顯著性(P<0.01)。各組給藥后其Hyp的表達情況:中藥組Hyp含量明顯下降,與模型組比較P<0.05、與西藥組比較P>0.05無統計學意義；而西藥組與模型組比較P<0.05也有統計學意義。

表1 大鼠肝組織Hyp含量表達情況

3.2 對大鼠肝組織α-SMA、Smad3表達的影響

見表2、表3。表2為各組肝組織α-SMA、Smad3染色灰度值(表達產物)情況，灰度值越高，表達產物越少；灰度值越低，表達產物越多。

由表2可見，空白組灰度值與模型組比較有顯著性差異(P<0.01，P<0.01)；西藥組與模型組比較其α-SMA、Smad3灰度值也分別有顯著性差異(P<0.01，P<0.05)；而中藥組在與模型組比較差異顯著(P<0.01，P<0.01)，即與西藥組比較也有統計學意義P<0.05，P<0.01)。

表2 各組肝組織α-SMA、Smad3灰度值比較

表3為各組肝組織α-SMA、Smad3染色陽性面積比較情況。由表3可見，空白組與模型組比較有顯著性差異；西藥組與模型組比較也分別有顯著性差異(P<0.01，P<0.01)；中藥組比模型組其α-SMA、Smad3染色面積差異顯著(P<0.01，P<0.01)，即與西藥組比較其Smad3染色面積也有顯著性差異(P<0.01)。

表3 各組肝組織α-SMA、Smad3染色陽性面積

4 討論

肝纖維化的共同病理特征是肝細胞外基質尤其是膠原的過量沉積[8]。其發生發展過程，先是由于肝細胞損傷，進一步激活肝星狀細胞(HSE)，而后者又導致肝細胞外基質(ECM)的不斷沉積，從而導致肝纖維化的發生[9-10]。

α-SMA是肝組織中的一種特有標志性蛋白，是肝星狀細胞(HSE)活化、增殖、過度分泌的顯著指標，與肝纖維化程度存在正相關系[11]。而HSC的活化、細胞外基質(ECM)的合成以及肝纖維化的形成發展尚必須有Smad3的參與[12]。在肝纖維化形成過程中。Smad3作為肝細胞內主要信號傳導介質，通過細胞漿至細胞核之間的信號傳遞來調控目的基因的表達，實現活化HSC、促進ESM合成等效應[13]。羥脯氨酸(Hyp)是一種非必需氨基酸，是構成組織內膠原蛋白的主要成分之一，測定其在膠原組織中的含量是衡量膠原代謝的重要指標[14]，肝纖維化時由于ECM內膠原組織明顯增加導致Hyp含量的升高，因此直接檢測肝組織中的Hyp含量可反映出肝纖維化的程度[15]。

有研究工作提示，中醫中藥抗肝纖維化的作用機理可能通過以下途徑實現：(1)抑制肝星狀細胞(HSC)激活、促進其凋亡[16]；(2)阻斷由于ESC的自分泌引起的遞鏈反應，從而阻止肝纖維化的進展[17]；(3)下調 Smad3、α-SMA蛋 白表達 ，進而抑制肝星狀細胞活化，達到阻止肝纖維化進展的目的[18]。

扶正祛邪是中醫對肝纖維化的根本治療原則[19]，而肝腎陰虛、瘀血阻滯則是“指南”中中醫主要辨證分型之一[20]。肝為剛臟，體陰而用陽，我們在長期臨床工作中體會到，肝纖維化的發生發展與肝腎陰虛有著密切關系，這和某研究工作相吻合[21]，即肝腎陰虛為本，瘀血濕毒是標。養陰活血解毒方以當歸、熟地黃、白芍、枸杞滋養肝腎；桃仁、紅花、川芎、丹參活血化瘀；柴胡、香附疏肝解郁導滯；茵陳、白花蛇舌草清解肝膽濕毒，臨床上可以取得很好的治療效果。

本研究工作結果顯示，中藥組對模型大鼠肝組織Hyp的表達有明顯抑制作用，與模型組比較P<0.05；西藥組與模型組比較也有顯著性差異(P<0.05)；中藥組與西藥組之間比較無統計學意義。

對肝組織α-SMA、Smad3表達的影響，中藥組與模型組比較，均有顯著性差異(P<0.01)，即與西藥組比較，也分別具有顯著性差異(P<0.05)。

本研究結果顯示,養陰活血解毒方可明顯抑制實驗大鼠肝組織Hyp以及α-SMA、Smad3的表達，從而實現對肝纖維化的治療作用。