養陰解毒方對人肺腺癌耐藥細胞PC9/R信號蛋白AKT磷酸化及PTEN表達影響研究

張婷，李昂，孫建立

(1.上海中醫藥大學附屬龍華醫院 腫瘤六科，上海 200030；2.復旦大學附屬華山醫院 中醫科, 上海 264000；3.武漢市漢南區人民醫院 中醫科，武漢 430090)

靶向治療已成為肺癌的主要治療方法，對于EGFR基因敏感突變的患者效率達70%，且具有耐受性好、毒副作用小、生活質量高等優點，但是多項研究表明靶向治療NSCLC的中位無疾病進展生存期僅有10個月左右[1-4]，如何延緩耐藥成為肺癌靶向治療研究的熱點和難點。

“證”是辨證論治的核心，我們以國醫大師劉嘉湘“扶正治癌”理論為指導[5]，通過對中醫辨證結合吉非替尼治療非小細胞肺癌后中醫證侯變化的特點進行觀察分析，結果發現吉非替尼治療后肺癌患者中醫證侯有獨特的變化規律，在國內首先提出靶向治療肺癌后中醫病機特點以“熱毒傷陰，余毒未凈”為主[6]，擬養陰解毒方并進一步探討了養陰解毒方對吉非替尼增敏的作用和機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞

吉非替尼耐藥細胞株PC9/R細胞由上海同濟大學附屬肺科醫院腫瘤研究所周彩存教授惠贈。

1.1.2 動物

Sprague-Dawley大鼠，10～11周齡，SPF級，雄性，體質量(350±50)g，60只，由上海新萊克實驗動物有限責任公司[SYXK(滬)2010-0095]提供，飼養于上海中醫藥大學附屬龍華醫院SPF級動物房，室溫25 ℃，濕度70%，自由進食、飲水。實驗經大學動物實驗倫理委員會批準。

1.1.3 藥物及試劑

養陰解毒方(YYJD)由北沙參、天門冬、夏枯草、石上柏、山慈菇等組成，加水10倍量浸泡40 min，煎煮，沸后計時，煎煮1 h，過濾，藥渣加水10倍量，煎煮1 h，濾過，合并兩煎濾液，濃縮至一定稠度，真空干燥(60 ℃)，得浸膏粉70.7 g。每g干膏粉相當于1.697 g生藥。

吉非替尼(G)：由英國AstraZeneca公司生產，上海阿斯利康公司提供；AnnexinV凋亡檢測試劑盒購于BD公司；P-Akt、Akt抗體及GAPDH購于CST公司；PTEN抗體購于Abcam公司；CCK-8試劑盒、羊抗兔HRP標記二抗及羊抗鼠HRP標記二抗購于碧云天生物有限公司。

1.1.4 養陰解毒方含藥血清的制備

將SD大鼠60只隨機分為4組，每組15只。中藥分三個劑量組，高、中、低劑量分別為生藥35 g/(kg·d)、17.5 g/(kg·d)和8.75 g/(kg·d)，空白對照組以等體積生理鹽水，灌胃前禁食12 h。每日2次灌胃，共灌胃3 d，末次灌胃后1～2 h行腹主動脈取血，采血后離心(2 000 r/min，10 min)，分離血清，各組混合成一無菌離心管，56 ℃水浴箱滅活抗體30 min，采用0.22 μm濾器除菌后分裝，于-80 ℃冰箱保存備用。

1.2 方法

1.2.1 細胞增殖抑制檢測

采用CCK-8法，抑制率按下列公式計算：抑制率(%)=[ (空白組OD值-實驗組OD值)/(空白組OD值-對照組OD值)]×100%，繪制量效曲線，計算出半數抑制濃度(IC50)值，實驗重復3次。體外兩藥聯合應用時，用金正均法(即金氏公式法)求協同指數(Q值)，再判斷拮抗、相加、協同效果。

1.2.2 細胞凋亡和周期的檢測

將細胞接種于6孔板中，實驗藥物處理72 h，對細胞進行胰蛋白酶消化，用70%乙醇固定4 h，孵育30 min后用碘化丙啶(400 μL)染色。立即用流式細胞術分析細胞周期。使用Annexin V凋亡細胞檢測試劑盒檢測細胞凋亡。用流式細胞儀進行細胞DNA含量的測定，確定細胞在各細胞周期所占比例。每個實驗重復3次。

1.2.3 Western blot檢測AKT、p-AKT及PTEN的表達

將需要抽提的蛋白的細胞從培養箱中取出，吸去培液，適量預冷的1×PBS洗滌2次，吸去PBS，加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解液，4 ℃充分裂解細胞，將細胞刮入1.5 mL EP管中，95 ℃以上加熱10 min，12 000 r/min離心10 min，取上清，進行蛋白質定量，根據目的蛋白的分子量選擇不同的凝膠濃度，以GAPDH作為內參基因，同樣進行以上操作。以p-AKT以及PTEN與GAPDH條帶吸光度比值作為其蛋白表達水平。

1.3 統計方法

實驗數據用均數±標準差(Mean±SD)表示，并采用SPSS 18.0統計分析軟件進行數理統計分析，對各組實驗數據先用Kolmogrov-Smitnov法和Shapiro-Wlik法進行正態性檢驗，再用Levene法進行方差齊性分析，若符合正態分布和方差齊性，則采用一般線性模型進行兩因素兩水平(2×2)析因設計的方差分析，多重組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。若經數據轉換后方差仍然不齊，則行Kruskal-Wallis法；若數據不符合正態分布，則進行非參數多重秩和檢驗，多重組間兩兩比較用Nemenyi法，P<0.05表示有統計學意義。

2 結果

2.1 養陰解毒方及其結合吉非替尼對人肺腺癌獲得性耐藥株PC9/R細胞增殖抑制作用

高、中、低劑量養陰解毒方組(YYJD組)根據含藥血清濃度分5組，與單藥吉非替尼組(G組)(5 μmol/L)作對照，結果見表1，通過計算養陰解毒方的IC50，選擇高劑量養陰解毒方含藥血清濃度為8%，中劑量為8.8%，低劑量為41.7%，與不同濃度吉非替尼聯合對PC9/R的作用，結果見表2。均為培養箱培養48 h后檢測。

表1 養陰解毒方對耐藥人肺腺癌PC9/R的抑制率

表2 養陰解毒方聯合吉非替尼對耐藥人肺腺癌PC9/R的抑制率

研究結果顯示養陰解毒方較吉非替尼而言有較好的抑制耐藥細胞的作用，并有較好的量效關系。吉非替尼聯合養陰解毒方各劑量組均能在吉非替尼較低濃度時增強抑制細胞生長的作用，養陰解毒方中、低劑量聯合吉非替尼干預組在低濃度均比吉非替尼單藥組能抑制細胞增殖。以金正均法計算藥物交互作用，吉非替尼聯合養陰解毒方低劑量各組Q值均>0.85，具有效應相加及協同作用，尤其為吉非替尼低濃度組加養陰解毒方低劑量組協同作用明顯；吉非替尼最低濃度藥物敏感度從5.506%提高到57.29%,結果具有統計學意義(P<0.01)。

2.2 養陰解毒方對耐藥人肺腺癌PC9/R細胞凋亡的影響

吉非替尼(5 μmol/L)和養陰解毒方(低劑量組含藥血清濃度為40%)分別作用于PC9/R細胞，流式細胞術檢測各組細胞凋亡比例結果見表3。養陰解毒方可誘導PC9/R細胞凋亡，抑制正常細胞增殖并增加早期凋亡細胞，均有顯著統計學意義(P<0.01)；兩藥聯用組較吉非替尼單藥組可明顯提高吉非替尼誘導PC9/R細胞凋亡的能力，有顯著統計學意義(P<0.01)；且兩藥聯用組較養陰解毒方組可促使細胞凋亡速度加快，有統計學意義(P<0.05)。上述結果表明養陰解毒方可誘導人肺腺癌獲得性吉非替尼耐藥PC9/R細胞凋亡，抑制正常細胞增殖并增加早期凋亡細胞，兩藥聯用組較吉非替尼單藥組可明顯提高吉非替尼誘導PC9/R細胞凋亡的能力。

表3 養陰解毒方含藥血清及其結合吉非替尼誘導PC9/R細胞凋亡的作用

2.3 養陰解毒方對耐藥人肺腺癌PC9/R細胞周期的影響

吉非替尼和養陰解毒方分別作用于PC9/R細胞，經流式細胞術檢測各組別細胞周期情況如表4。養陰解毒方組及聯合用藥組干預后人肺腺癌PC9/R細胞S期(DNA復制期)均較吉非替尼單藥細胞周期縮短，有明顯差異(P<0.01)；G0-G1期(DNA合成前間期)養陰解毒方組及聯合用藥組均能較吉非替尼單藥明顯使細胞停滯在此期，有顯著統計學意義(P<0.01)；而G2-M期(DNA合成后間期)吉非替尼單藥組與養陰解毒方組有明顯細胞比例增高，有顯著統計學意義(P<0.01)，聯合用藥組較吉非替尼單藥組細胞差異無明顯著統計學意義(P>0.05)。以上實驗結果表明養陰解毒方可有效抑制耐藥細胞的DNA合成活性，養陰解毒方可使耐藥細胞停滯在DNA合成前、后間期，聯合用藥可使耐藥細胞停滯在DNA合成前間期。

表4 養陰解毒方及其結合吉非替尼對耐藥人肺腺癌PC9/R細胞周期的影響

2.4 養陰解毒方對PC9及PC9/R細胞P-Akt和P-Akt表達的影響

各組細胞經干預48h后，收集細胞，Western Blot檢測各組細胞AKT通路活化表達水平，60KD處出現p-AKT(Thr308)及p-AKT(Ser473)的特異性顯色帶，結果如表5，圖1。人肺腺癌吉非替尼耐藥PC9/R細胞株在吉非替尼干預下AKT兩主要活化位點表達均明顯超過人肺腺癌吉非替尼敏感細胞株PC9細胞株，有統計學意義(P均<0.05)；養陰解毒方組與聯合用藥組均比單藥吉非替尼單藥干預組能加強抑制PC9/R的p-AKT活化位點Thr308的磷酸化，有統計學意義(P均<0.05)，同樣也能加強抑制p-AKT活化位點Ser473的磷酸化，有統計學意義(P均<0.05)。從表及圖中亦可見縱向比較，在人肺腺癌吉非替尼敏感PC9細胞株及其耐藥亞株中，P-AKT活化位點Ser473的活化程度均要比Thr308高。

表5 養陰解毒方及其結合吉非替尼對PC9及PC9/R的P-AKT表達的影響

注:每組第一柱結合位點為Thr308,第二柱結合位點為Ser473

2.5 養陰解毒方及其結合吉非替尼對PC9及PC9/R細胞PTEN表達的影響

各組細胞經干預48h后，收集細胞，Western Blot檢測各組細胞PTEN表達水平，54KD處出現PTEN的特異性顯色帶，結果如表6，圖2。人肺腺癌吉非替尼耐藥細胞株PC9/R的PTEN表達顯著低于敏感細胞株PC9，有統計學意義(P<0.01)；聯合用藥組耐藥株PC9/R的PTEN表達顯著高于其余各組，有統計學意義(P<0.01)；其中養陰解毒方干預的耐藥細胞株PC9/R與吉非替尼干預的敏感細胞株PC9無明顯差異(P>0.05)。

表6 養陰解毒方及其結合吉非替尼對PC9及PC9/R的PTEN表達的影響

圖2 各干預組PTEN表達的檢測

3 討論

隨著靶向治療在肺癌中的廣泛應用，中醫藥結合靶向治療的研究也越來越多，如何運用中藥延緩吉非替尼吉非替尼的耐藥成為研究的方向之一。本課題組前期研究[6-7]發現經吉非替尼治療后肺癌患者有從氣虛向氣陰兩虛、氣陰兩虛向陰虛轉化的趨勢，顯示吉非替尼治療后肺癌患者中醫證侯有獨特的變化規律，在國內首先提出吉非替尼治療肺癌后中醫病機特點為以“熱毒傷陰，余毒未凈”為主，論治以養陰解毒法為主。結合國醫大師劉嘉湘對肺癌靶向患者中藥治療的經驗，選擇北沙參、天門冬、夏枯草、石上柏、山慈菇等中藥組成養陰解毒方，進行系列的臨床觀察和實驗研究[8]。本課題選擇吉非替尼耐藥的人肺腺癌PC9/R細胞株，研究養陰解毒方及其結合吉非替尼的作用和機制，結果顯示養陰解毒方對耐藥人肺腺癌細胞株PC9/R細胞的增殖有抑制作用，并顯示一定的量效關系，養陰解毒方高、中、低劑量組均能夠在吉非替尼低劑量應用時增加人肺腺癌PC9/R細胞株對吉非替尼的敏感性；尤以低劑量組效果更優，兩藥聯合使用有明顯的增效作用。養陰解毒方單藥以及聯合用藥組均能抑制人肺腺癌細胞PC9的DNA復制；吉非替尼誘導細胞停滯在G0-G1期，而養陰解毒方組及聯合用藥組誘導細胞停滯在G2-M期，證實養陰解毒方所誘導細胞凋亡機制與吉非替尼并不完全相同。養陰解毒方以及聯合用藥組均可抑制人肺腺癌獲得性耐藥細胞PC9/R的增殖活性(DNA復制期細胞減少)，使細胞停滯在G0-G1期；吉非替尼單藥組DNA復制期細胞活躍，G2-M期細胞數較其余各組增多。證實養陰解毒方及吉非替尼對原代細胞及耐藥細胞誘導凋亡機制有差異，養陰解毒方及聯合用藥組對耐藥細胞株PC/R有明顯的抑制作用，且與其在原代細胞PC9誘導凋亡的機制并不完全相同。

研究表明EGFR-TKI的耐藥機制十分復雜[9]，主要為EGFR基因突變或靶點缺失，避開EGFR通路的其他TK受體活化，胞內EGFR下游信號蛋白非依賴性或組成性活化。其中，PI3K/Akt信號通路在EGFR-TKI耐藥中扮演了重要角色，而PTEN可調節PI3K/Akt通路，與多種腫瘤的轉移有關。PTEN是一個具有雙特異磷酸酶活性的抑癌因子[10-11]，是PI3K/Akt信號級聯通路的主要負調節蛋白，PTEN功能的缺失導致Akt通路的過度活化，在EGFR抑制劑耐藥過程中起著重要的作用，外源性PTEN基因對人肺癌細胞株SPC-A-1增殖凋亡及侵襲有明顯的抑制作用[12]。

本實驗研究結果顯示吉非替尼獲得性耐藥后，PC9/R表現出了磷酸化AKT的表達上升，可能與PI3K/AKT信號通路被旁路激活有關，而敏感細胞PC9在此通路仍被抑制。并從中可見由于Ser473結合位點磷酸化的表達大于Thr308的磷酸化表達，可能為主要的AKT活化的因素，而養陰解毒方及兩藥聯合可以有效抑制從Ser473位點激活AKT磷酸化的表達，養陰解毒方可通過干擾AKT的磷酸化逆轉吉非替尼的耐藥。

耐藥細胞株PC9/R的PTEN表達低下，養陰解毒方聯合用藥顯示出其顯著的促進抑癌基因PTEN表達的能力，這可能與養陰解毒方可對Ser380、Thr382、Thr383位點磷酸化的激活有關。養陰解毒方單藥仍可顯示出其糾正抑癌基因PTEN低表達的作用，在耐藥細胞適應濃度下可提高其抑癌基因的表達至吉非替尼敏感株PC9的同等水平。

綜上所述，養陰解毒方可抑制重要耐藥發生信號通路關鍵蛋白AKT在Thr308與Ser473位點的活化，可調節耐藥細胞株PC9/R的PTEN的表達恢復到非耐藥細胞表達水平；兩藥聯用可顯著上調PTEN的表達，抑制PI3K/AKT通路活化的信號，從而起到抑制腫瘤生長、逆轉耐藥的雙重作用，為進一步開展養陰解毒方的臨床研究提供科學的實驗依據。