四川盆地核桃黑斑病病原菌的分離、鑒定與核桃抗病性評價

楊漢波, 韓珊, 何丹, 蔣時姣, 曹廣黎, 萬雪琴

(長江上游林業生態工程四川省重點實驗室，長江上游森林資源保育與生態安全國家林業和草原局重點實驗室，華西雨屏區人工林生態系統研究長期科研基地，四川農業大學生態林業研究所，成都，611130)

核桃黑斑病，又名核桃黑腐病，幾乎是世界上所有核桃主要產區最嚴重的地上部分病害[1-3], 導致落果嚴重，嚴重時落果率達60%以上，開花前后發生的感染可以使產量損失達到80%[4-6]。核桃細菌性黑斑病病原菌是專化寄生胡桃屬(Juglans)病原細菌[7-8]。我國有關核桃黑斑病菌大都命名為Xanthomonas camperstrispv. juglandis，后來又被命名為X. arboricolapv. juglandis，也有部分報道為X.juglandis[6,9-10]。陳善義等[11]對北京地區核桃黑斑病病原菌16S rDNA序列進行分析，認為其病原菌為X. campestris。美國加州核桃細菌性黑斑病菌株的dnaK和rpoD基因分析表明，致病菌的基因序列與X. arboricola非常接近，rDNA基因分析結果表明與X. arboricola、X. gardneri和X. vesicatoriajie均接近[12]。Stefania等[13]采用AFLP分子標記技術，對法國、英國和意大利等8個國家的66個核桃黑斑病致病菌鑒定為X. arboricolapv. pruni、X. arboricolapv. corylina、X. campestrispv. campestris、X. fragariae、X. hortorum和X. axonopodispv. vesicatoria。

目前，任何核桃品種(無性系)對黑斑病都不具有完全免疫[14]。采用化學防治，存在無法掌握殺菌劑最佳使用時間及其對環境和自然生態系統的影響等問題，因此，使用抗病育種方法獲得抗性栽培品種仍是最為有效和可靠的核桃黑斑病防治方法[1,15-16]。Soltani等[17]對16個核桃基因型接種病原菌X. arboricolapv. juglandis進行抗病性試驗，篩選出最抗病基因型94和最感病基因型69。Botu等通過對550個英國核桃無性系進行田間測試和形態學特征，篩選出3個(Valcor、Valmit和Valrex)抗黑斑病的無性系[18]。我國西南地區核桃產區高濕高熱環境為病原菌的侵染提供了良好的先決條件，加之引進的北方品種展葉較早，黑斑病十分普遍并持續發生，已成為影響該地區核桃產業發展的主要限制因素[19]。本研究對引起四川盆地地區核桃黑斑病的病原體進行分離和致病性測定，依據病原菌形態學,并結合16S rDNA基因序列構建系統發育樹，確定病原菌的種類；同時，通過田間人工接種分離的病原物，對收集的四川18個核桃栽培品種(無性系)進行抗病性鑒定，以期為核桃黑斑病的準確識別、抗病機理研究和抗病新品種選育提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 材料

用于抗性評價的18個核桃(Juglans regia)栽培品種(無性系)信息見表1, 均保存于四川農業大學崇州現代農業研發基地(103°67′ E，30°63′ N)，基地位于四川省崇州市, 屬典型亞熱帶季風性濕潤氣候，年均溫15.9℃, 年均日照時數1 161.5 h，年均降雨量1 000 mm以上，且主要集中在夏季，試驗地能充分代表四川盆地的氣候特點。

表1 用于抗病評價的核桃品種(無性系)Table 1 Cultivars (clones) used for resistance evaluation

用于病原菌分離的寄主材料取自四川盆地地區核桃林，采集表現出黑斑病癥狀的當年生幼嫩葉片、幼果共計36份，用濕紗布擦洗干凈放入自封袋中，做好標記并裝入冰袋帶回實驗室保存于-20℃冰箱中備用。2 a生健康核桃苗用于回接試驗，進行致病性測定。

1.2 病原菌的分離純化與回接試驗

對采集的試驗材料進行拍照、整理和編號，然后對疑似黑斑病的葉片、幼果進行病原菌的分離和純化。用平板劃線法分離病原菌[20]：將具有典型癥狀的核桃病葉用無菌水清洗干凈，自然晾干后剪成10個5 mm×5 mm的小塊病組織；75%酒精浸泡5 s,立即用無菌水清洗3次；放入0.1%的升汞溶液中浸泡1 min，無菌水清洗3次；將病葉組織置于滅菌的載玻片上，滴加無菌水，并用滅菌的玻璃棒充分研碎；用滅菌移植環蘸取研碎的組織液于NA平板上劃線培養，每份材料重復3次；最后將平板翻轉并做好標記，將其置于28℃、12 h/12 h光暗交替的恒溫培養箱中培養。將分離得到的病原菌放到LB平板上進行純化培養，純化后的菌落轉移到LB液體培養基中擴大培養，-80℃保存備用[21]。

采用針刺涂抹法和柯赫氏法則進行回接試驗。將保存的菌株劃線轉移至LB平板，28℃活化培養3~4 d，然后挑取單菌落進行擴大培養，配制成108CFU/mL的菌體懸浮液。選取健康的2 a生核桃苗，采取針刺涂抹法于葉背面接種(先用滅菌束針輕刺葉片，再用毛筆刷蘸取少量菌液，涂抹于葉背面進行接種)，接種后覆上一層保鮮膜，保濕培養24 h后去掉保鮮膜，并設置空白LB液體接種葉片作為對照。每處理接種6片葉，重復3次。7~10 d后記錄發病情況，根據柯赫氏法則，待病原菌接種部位表現典型的黑斑病癥狀時，對發病的組織重新進行病原菌的分離與鑒定，并觀察分離出的病原菌形態特性是否與之前的相同，初步確定核桃黑斑病的病原菌，再根據其發病率和嚴重度確定病原細菌的致病力大小。

1.3 病原菌形態學鑒定

將黑斑病病原菌活化培養于LB平板培養基上,28℃培養3 d后在OLYMPUS光學顯微鏡下觀察菌落的形態特征，包括菌落表面(顏色、形狀、大小、質地和光澤度)、是否隆起、邊緣和透明度等重要的鑒別特征。

1.4 病原菌分子鑒定

利用天根細菌總DNA提取試劑盒提取代表菌株28-2基因組DNA，稀釋10倍備用。以DNA為模板，采用細菌通用引物27F/1492R (正向: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向: 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進行PCR擴增。PCR擴增體系為25μL：DNA模板1μL，Taq聚合酶(2×) 12.5μL,正反向引物各1μL，去離子水補足至25μL。反應程序為：95℃預變性5 min，94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸45 s，35個循環，最后72℃延伸10 min，4℃保存。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，然后將菌株28-2的PCR產物送上海擎科生物技術公司進行16S rDNA測序。

將測序獲得的序列在NCBI基因數據庫中進行比對，并于GenBank已登錄的相似序列進行同源性比對，利用MEGA X軟件采用鄰接法(neighborjoining method)構建系統發育樹，分析其親緣關系。將病原菌的親緣關系分析結果與其形態特征、培養性狀及致病性結合起來對其進行鑒定。

1.5 抗病性評價

將菌株28-2活化后配置107CFU/mL菌體懸浮液。選取健康且長勢一致的核桃品種(無性系)各13株，10株用于接種，3株為對照，從外圍枝的頂葉上選取從外往里數長勢良好的第二對小葉(12片/株),并做好標記，采用針刺涂抹法接種，接種植株均為1 a生嫁接苗。以接種無病原菌的LB液為對照。接種后覆層保鮮膜，保濕培養48 h后揭除，10 d之后統計每株葉片的發病情況。

調查品種(無性系)的發病率(%)=發病的點數/調查總點數×100%，采用十字交叉法測量黑斑病的病斑直徑，并進行分級[22], I級病斑癥狀不明顯甚至無癥狀；II級病斑直徑≥2.0 mm；III級病斑直徑2.1~4.0 mm；IV級病斑直徑4.1~6.0 mm；V級病斑直徑≥6.1 mm。參照盛寶龍等[23]的方法計算病情指數(%)=∑(病點數×病級)/(調查總點數×最高病級)×100%，并將核桃品種(無性系)對黑斑病的田間抗性分為4級：高抗(HR)的病情指數為0.00~24.00，抗病(R)的病情指數為24.01~31.00，感病(S)的病情指數為31.01~40.00，高感(HS)的病情指數≥40.01。

2 結果和分析

2.1 病原菌的分離、純化和致病性測定

對從四川各地采集的36份核桃病葉、病果進行病原菌分離純化，獲得單菌落的菌株18株，經形態學初步鑒定，主要分為4類：黃單胞桿菌屬(Xanthomonas)、短小桿菌屬(Curtobacterium)、泛菌屬(Pantoea)和金黃桿菌屬(Chryseobacterium)，分離率分別為黃單胞桿菌屬(33.33%)>短小桿菌屬(27.78%)>泛菌屬(22.22%)>金黃桿菌屬(16.67%)。從葉片分離的菌落較純, 且分離率較高，而從果實上分離的菌落比較雜亂, 說明核桃果實更容易受到多種病菌的復合侵染。對分離的4類菌株進行回接試驗，接種7 d后, 只觀察到黃單胞菌屬菌株能引起植株發病。分離回接試驗感病組織病原菌，其菌落形態與原分離的病原菌菌落形態相一致，確定該病菌與病樣分離獲得的病原菌為同一病菌, 符合柯赫氏法則，說明黃單胞桿菌屬(Xanthomonas)是四川盆地核桃黑斑病的病原菌。

2.2 病原菌的形態特征及分子鑒定

篩選獲得的6個黃單胞桿菌屬菌株形態特征基本相同，均表現為圓形、光滑、隆起，前期顏色為乳白色，后期均發展為淺黃色，質地均較粘稠(圖1: A)。顯微鏡下觀察，6個菌株的單個菌體均呈短桿狀，菌體大小為(0.3~0.8)μm×(1.0~2.4)μm, 革蘭氏染色反應為陰性(圖1: B)。將分離獲得的菌株回接到健康2 a生核桃植株葉片上，均能產生典型的黑斑病病斑。再次分離并挑取單菌落純化，經組織培養和菌體形態學觀察比較，再分離的病原菌與最初用于接種分離的菌株無差異，說明致病菌與接種菌為同一種菌，符合柯赫氏法則。

從分離的菌株中選取代表病原菌株28-2進行基因組DNA提取，以提取的基因組DNA為模板，使用通用引物27F/1492R擴增得到長度約為1 446 bp的16S rDNA片段(圖2: A)。將獲得的16S rDNA序列在GenBank中進行BLAST比對分析，結果表明，其與樹生黃單胞桿菌(Xanthomonas arboricola) (登錄號：KP340804.1)的相似性高達99%。系統發育樹分析結果表明菌株28-2與黃單胞桿菌的親緣關系最近，位于系統發育樹的同一分支(圖2: B)。因此，結合致病性測定的結果、病原菌形態學特征和序列分析，將菌株28-2鑒定為樹生黃單胞桿菌，初步確定四川盆地地區核桃細菌性黑斑病的病原菌為樹生黃單胞桿菌。

2.3 抗病性評價

圖2 菌株的16S rDNA PCR擴增電泳圖和基于16S rDNA基因序列構建的系統發育樹Fig. 2 PCR amplification of 16S rDNA, and phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences

接種后，所有測試品種(無性系)的葉片均不同程度感病，接種后2~3 d開始出現小病斑，第7天病斑大量出現，但整體發病程度較輕(圖3: A)。因此，本次田間抗性調查在接種后的第10天進行。供試的18個核桃品種(無性系)中未發現對黑斑病免疫的品種，均不同程度發病，發病率為35.07%(Shujiang1)~78.57% (Yanyuanzao)，變異系數為17.62%，其中14個品種(無性系)發病率在50.00%以上(圖3: B)。病情指數為0.18% (Shujiang1)~0.24% (Yanyuanzao)，變異系數為0.29%，變化趨勢與發病率基本一致(圖3: C)。根據抗病性評價標準,篩選出抗病品種(無性系)共10個(5個HR品種、5個R品種)，其中本地優良無性系6個，占抗病品種的60.00%；感病品種(無性系)中，栽培品種占5個(4個S品種，1個HS品種)，占感病品種(無性系)的62.50%，說明本地優良無性系總體的抗性要強于栽培品種。

圖3 田間植株葉片侵染情況和品種抗病評價Fig. 3 Leaf infections in field and resistance evaluation of walnut cultivars (clones)

3 結論和討論

我國對核桃細菌性黑斑病的相關研究主要集中在病害診斷、預測與防治等方面[6]。為進一步明確我國核桃黑斑病病原菌分類地位，本文對引起四川盆地地區核桃黑斑病的病原菌進行分離和鑒定,并通過柯赫氏法則驗證分離病原菌的致病性，為從形態和分子上進行病原菌鑒定和分類提供了數據。同時采用田間接種評價方法，對四川省18個核桃栽培品種(無性系)進行抗病性評價。

本研究對黑斑病病原菌的形態進行觀察，結果表明，此病原菌的菌落、菌體等形態和培養特征與已報道的核桃細菌性黑斑病病原菌黃單胞菌屬細菌相似[11,24-25]。本試驗通過病原菌的形態學觀察不能將其鑒定到黃單胞菌屬中具體的種，因此，需要通過分子生物學手段進行進一步鑒定。而關于核桃黑斑病病原菌的命名存在爭議，最早官方公認名稱為X. campestrispv. juglandis (Pierce) Vauterin, 后命名為X. arboricolapv. juglandis (Pierce) Vauterin，最近有提議更名為X. juglandis(Pierce) Dowson[10,26-27]。Adaskaveg等根據dnaK、rpoD和rDNA基因分析,認為美國加州核桃細菌性黑斑病致病菌與X. Arboricola、X. gardneri和X. vesicatoriajie接近。Daiva等[28]通過fyuA、gyrB和rpoD基因序列分析，認為立陶宛和波蘭區核桃黑斑病病原菌為X. arboricolapv. juglandis。陳善義等[11]報道北京郊區核桃黑斑病病原菌的16S rDNA序列與X. campestris和X. arboricola的某些變種相似性為99%, 但具體病原菌的鑒定還需進一步研究。王瀚等[25]采用形態學鑒定和16S rDNA序列分析，將甘肅隴南核桃黑斑病病原菌鑒定為X. campestris。曲文文[29]采用形態鑒定和ITS序列分析，將山東省核桃黑斑病病原菌鑒定為X.arboricola。因此，采用形態學與分子生物學相結合的方法能夠對致病病原菌進行準確鑒定。為此, 本研究根據16S rDNA基因序列構建了系統發育樹, 對病原菌進行鑒定，結果表明病原菌的16S rDNA基因序列與已登錄的X. arboricola(登錄號: KP340804.1)親緣關系最近，相似性高達99%。結合病原菌形態學特征，本研究將四川盆地地區核桃黑斑病病原菌鑒定為變形菌門(Proteobacteria)假單胞菌科(Pseudomonadaceae)樹生黃單胞菌屬細菌X. arboricola。四川省2000-2008年栽培核桃主要為北方引進品種,這可能是四川盆地區與山東省核桃黑斑病為同一致病病原菌的原因之一。同時，與其他地區核桃黑斑病病原菌種存在差異，也表明我國不同生態環境下引起核桃黑斑病病原菌的多樣性，對探索核桃細菌性黑斑病的發病規律、準確識別和有效防治技術研究具有重要的理論和指導意義。

四川省近年來實施退耕還林，為促進山區農村經濟發展，大范圍推廣核桃栽培，并從其它核桃主產區調運苗木，但由于四川高濕熱的環境條件，引進的北方早實核桃受到黑斑病害困擾造成大面積減產或死亡及品質的下降，已成為影響四川核桃產業發展的主要因素[19]。近年來，隨著一大批本地選育優良核桃種質在生產中的使用，對四川核桃產業的健康發展起到一定的促進作用[30]。在調查中發現四川盆地區本地核桃種質材料發病率較低，說明本地優良的核桃種質材料可能對核桃黑斑病有一定的抗性。因此，本研究采用田間接種的方法對四川栽培品種和收集的本地優良無性系進行黑斑病抗性評價，其中Shujiang1、Qingxiang、Panhe1、91和86號被評價為高抗品種，病情指數為17.71%~23.88%；Yanyuanzao和200號為高感病品種，病情指數分別為51.96%和40.10%。這些被病原菌感染但表現出較強抗性的表型在育種中被認為可能獲得持久和廣泛的抗性，這些材料可作為進一步抗病品種選育的優良材料[31]。Jiang等[32]采用田間調查法、室內離體葉片接種法進行核桃黑斑病抗性調查，結果表明，Shujiang1屬于易感病品種，與本研究結果不一致，可能原因一是試驗材料的差異，本試驗材料為1 a生嫁接苗，而Jiang等采用的8 a生結果樹，葉片結構的差異可能導致抗病性結果出現偏差；二是病原菌接種方法不同可能導致病原菌侵染能力的差異；三是環境條件不同也可能導致病原菌致病性的不同。在病害最流行時期和植株最易感病時期進行感病情況調查，能夠較真實地反映材料的抗性水平。因此，可采用田間調查和田間接種相結合的方法對核桃黑斑病抗病性進行準確評價，為抗病品種(無性系)的初步篩選和后續的抗病相關機制研究提供基礎。