鐵皮石斛花總RNA提取方法的比較研究

趙聰慧, 俞振明, 何春梅, 王浩斌, 司燦, 張明澤, 段俊*

(1. 中國科學院華南植物園, 中國科學院核心植物園, 廣東省應用植物學重點實驗室, 廣州 510650; 2. 中國科學院大學, 北京 100049)

石斛屬(Dendrobium)隸屬蘭科(Orchidaceae)樹蘭亞科(Epidendroideae)，是蘭科最大的屬之一，具有極高的觀賞價值，因其花香奇特、花朵秀麗、花形迷人與色澤鮮艷享譽世界，被稱為世界“四大觀賞洋蘭”之一[1-2]。鐵皮石斛(D. officinale)是珍稀的藥食同源傳統貴細中藥材，主要以干燥莖入藥，具有滋陰清熱、益胃生津、抗氧化、抗衰老、增強免疫力等功效[3]，是石斛屬中最為珍稀名貴的品種。對石斛屬植物的化學研究主要集中在莖、葉的多糖、石斛堿、黃酮等成分上[4-5]，而對于石斛花的研究較少。

鐵皮石斛花為可食用部分，產量豐富，具有很大的資源開發空間，在民間被廣泛加工成花茶飲用。花香是觀賞植物重要的審美和商品性狀之一，作為信號物質，具有招引昆蟲授粉等重要生態功能[6]。石斛屬植物花香的研究報道較少，鐵皮石斛的花香物質以萜類、脂肪族、芳香族化合物為主,尤其是蒎烯、檸檬烯、桉油素、芳樟醇、α-松油醇等單萜化合物[7]。鼓槌石斛的主要花香物質是α-蒎烯、β-羅勒烯、苯乙醛和乙酸辛酯[8]。鐵皮石斛花中富含多糖、揮發油、多酚類、花色素和黃酮類物質[7,9-11]，與莖、葉相比，花中總黃酮、總酚類物質含量更高，具有較高的抗氧化活性，而且還富含精氨酸等人體必需的氨基酸[10,12]。然而，關于石斛屬植物花中化合物合成的分子機理還不清楚，參與其合成的相關基因也鮮有報道[13-14]。因此，亟需開展花中化合物成分分析、生物合成途徑及關鍵物質合成的分子機制研究，以便更好地開發利用石斛花資源。

高質量、高純度RNA提取是植物分子生物學研究的基礎，如Real-Time PCR分析、Northern雜交分析、目的基因克隆、cDNA文庫構建等都需要高質量的RNA。常用的植物總RNA提取方法有TRIZOL法[15]、CTAB法[16]、SDS法[17]、異硫氰酸胍法[18]和試劑盒法[19]等。目前，以上方法均已應用于鐵皮石斛莖的總RNA提取[10-11]，但是不同植物或同種植物不同組織所含的成分存在較大差異，鐵皮石斛花的總RNA提取方法必須通過實驗才能確定。

因此，本研究針對鐵皮石斛花中黃酮、多糖、多酚等次生代謝物質含量高的特點，通過比較改良CTAB-LiCl法、改良CTAB-異丙醇法、改良SDS-LiCl法、改良SDS-異丙醇法以及試劑盒法等8種方法提取的總RNA質量，篩選并確定鐵皮石斛花的總RNA提取方法，為鐵皮石斛花香物質合成酶基因的表達、調控及其相關的分子生物學研究提供技術手段。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本研究使用的5種石斛屬植物花朵均采自廣東省廣州市中國科學院華南植物園石斛育種基地(25.14°N，113.35° E)，包括氣味略輕顏色淡黃的鐵皮石斛(Dendrobium officinale，圖1)、香氣濃郁色彩明黃的鼓槌石斛(D. chrysotoxum)、花呈淡黃綠色的霍山石斛(D. huoshanense)、氣味芬芳顏色明艷的金釵石斛(D.nobile)和美花石斛(D. loddigesii)，于盛花期(2019年4-5月)的晴天上午11:00每個品種隨機采摘10朵以上，設3次生物學重復，置于-80℃冰箱保存備用。

1.2 儀器和試劑

十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)、三羥甲基氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane, THAM]、焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate, DEPC)、十六烷基三乙基溴化銨(cetyltrimethyl ammonium bromide, CTAB)購自天津市科密歐化學試劑有限公司，多糖多酚植物RNA提取試劑盒(貨號：0416-50)購自北京華越洋生物科技有限公司，柱式植物RNAout 2.0試劑盒(貨號: 90404-50)購自北京天恩澤基因科技有限公司, RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(貨號：DP441)購自天根生化科技有限公司，Biospin多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(貨號：BSC65S1)購自杭州博日科技有限公司，RNA提取酚試劑(貨號：W0250)購自北京索萊寶科技有限公司，M-MLV反轉錄試劑盒(貨號：M1701)購自美國Promega公司，鐵皮石斛Actin基因引物由北京擎科生物科技公司合成, 聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone 40, PVP-40)、無水乙醇、三氯甲烷、β-巰基乙醇、異丙醇、氯化鈉等化學試劑均為分析純，購自廣州化學試劑廠。

試驗所用試劑瓶、研缽、鑷子、藥匙等非塑料制品在180℃下烘烤8 h后使用，塑料制品及試劑經0.1% (W/V) DEPC水處理12 h，121℃高壓滅菌30 min后，烘干備用。

1.3 花的總RNA提取方法

研究共采用了8種提取方法：改良CTAB-LiCl法(M1)、改良CTAB-異丙醇法(M2)、改良SDS-LiCl法(M3)、改良SDS-異丙醇法(M4)、多糖多酚植物RNA提取試劑盒法(M5)、柱式植物RNAout 2.0試劑盒法(M6)、RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒法(M7)、Biospin多糖多酚植物總RNA提取試劑盒法(M8)。

改良CTAB-LiCl法(M1)參照Zeng等[20]的方法并適當修改。稱取500 mg新鮮花朵，在液氮中快速研磨成粉末，轉移至2 mL離心管中，加入1 mL 65℃預熱的CTAB裂解液[2% CTAB (W/V), 2 mol/L NaCl, 25 mmol/L EDTA (pH=8.0), 100 mmol/L Tris-HCl (pH=8.0), 2%β-巰基乙醇(使用前加入)]，65℃水浴15 min，期間上下顛倒3~5次。加入900μL酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1,V/V), 劇烈振蕩30 s,于4℃下12 000×g離心10 min，將上清液轉移到新的離心管中，加入800μL氯仿/異戊醇(24∶1,V/V),劇烈振蕩30 s，于4℃下12 000×g離心10 min，將上清液轉移到新的離心管中。加入1/4體積的10 mol/L LiCl，于4℃冰箱中靜置過夜，于4℃下12 000×g離心30 min沉淀RNA，棄上清，沉淀用75%乙醇漂洗2次，于4℃下12 000×g離心5 min，棄上清，風干后，加入40μL DEPC水溶解RNA，于-80℃冰箱保存。

改良CTAB-異丙醇法(M2)參照張力鵬等[21]的方法并適當修改。稱取500 mg新鮮的鐵皮石斛花朵，液氮中研磨成粉末后迅速轉入含有500μL CTAB提取液[2% CTAB (W/V), 2% PVP-40 (W/V),0.045%亞精胺(W/V), 2.5 mol/L NaCl, 25 mmol/L EDTA (pH=8.0), 100 mmol/L Tris-HCl (pH=8.0), 2%β-巰基乙醇(使用前加入)]中，65℃水浴5 min，加入250μL氯仿，劇烈震蕩，于4℃下13 000×g離心5 min, 取上清液加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1,V/V)，劇烈振蕩，于4℃下13 000×g離心5 min, 取上清液加入等體積的異丙醇，溫和混勻后，-40℃冰箱放置30 min，于4℃下13 000×g離心10 min,RNA沉淀漂洗方法與M1相同。

改良SDS-LiCl法(M3) 參照Liu等[22]的方法并適當修改。稱取100 mg新鮮的鐵皮石斛花朵，加液氮充分研磨，加入RNA提取緩沖液[1% SDS (W/V),4% PVP-40 (W/V), 250 mmol/L NaCl, 20 mmol/L EDTA (pH=8.0), 50 mmol/L Tris-HCl (pH=8.0)]，迅速混勻后室溫放置5 min，于4℃下12 000×g離心5 min。將上清液轉移到新的離心管中，加入700μL酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1,V/V)，溫和混勻后, 于4℃下12 000×g離心5 min，將上清液轉移到新的離心管中，加入600μL氯仿/異戊醇(24∶1,V/V),劇烈振蕩30 s，于4℃下12 000×g離心5 min，將上清液轉移到新的離心管中。加入500μL 10 mol/L LiCl，冰上放置60 min，于4℃下12 000×g離心10 min，RNA沉淀漂洗方法與M1相同。

改良SDS-異丙醇法(M4)參照Cheng等[17]的方法并適當修改。稱取100 mg新鮮的鐵皮石斛花朵，液氮中研磨成粉末后迅速轉入含有1 mL 65℃預熱的SDS提取液[10% SDS (W/V), 1 mol/L NaCl, 2.5 mol/L Tris-HCl (pH=7.4), 100 mmol/L EDTA (pH=8.0), 4%β-巰基乙醇(使用前加入)]中,充分渦旋混勻，65℃水浴20 min，期間上下顛倒3~5次, 于4℃下13 000×g離心10 min。將上清液轉移到新的離心管中，加入1/2體積的RNA提取酚試劑，充分顛倒混勻，-20℃冰箱放置10 min，于4℃下13 000×g離心10 min。將上清液轉移到新的離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1,V/V), 顛倒混勻，于4℃下13 000×g離心10 min。將上清液轉移到新的離心管中，加入等體積預冷的異丙醇,-20℃放置30 min，于4℃下13 000×g離心30 min，RNA沉淀漂洗方法與M1相同。

多糖多酚植物RNA提取試劑盒法(M5)、柱式植物RNAout 2.0試劑盒法(M6)、RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒法(M7)、Biospin多糖多酚植物總RNA提取試劑盒法(M8)均按照說明書要求進行。

1.4 RNA質量濃度檢測

提取的RNA采用Nano DropTM2000c核酸蛋白分析儀(Thermo Scientific公司)進行測定，樣品檢測量為1μL，記錄樣品的A260nm/A280nm和A260nm/A230nm值和濃度，并計算RNA產率(μg/g)=RNA濃度(μg/μL)×稀釋倍數×RNA樣品體積(μL)/樣品質量(mg)。RNA條帶完整性使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 4.5μL樣品與0.5μL 10×Loading Buffer (TaKaRa公司)混勻后點樣，180 V電壓電泳10 min，用凝膠成像系統觀察電泳條帶并拍照。

1.5 RT-PCR檢測

將M4和M5方法提取的RNA，按照反轉錄酶M-MLV試劑盒說明書進行反轉錄合成cDNA，以該cDNA為模板，以鐵皮石斛Actin(NCBI登錄號：JX294908)[23]為內參基因進行擴增。正向引物：5′-ATATGCTAGTGGCCGCACAA-3′; 反向引物：5′-GCGGCTTCCATTCCAATCAG-3′。25μL PCR反應體系為：Yeasen PCR Master Mix 12.5μL，正向引物1μL,反向引物1μL，cDNA 1μL，ddH2O 9.5μL。擴增程序為：94℃預變性3 min，98℃變性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環，最后72℃延伸10 min。取4.5μL PCR產物，加入與0.5μL 10×Loading Buffer混勻后上樣, 于1%瓊脂糖凝膠儀上150 V電壓電泳15 min, 用凝膠成像系統觀察電泳結果并拍照。

1.6 其他石斛屬植物總RNA提取

采用M4和M5方法分別提取霍山石斛、金釵石斛、鼓槌石斛、美花石斛花朵的總RNA，檢測完整性、純度和濃度。

2 結果和分析

2.1 總RNA完整性檢測

凝膠電泳是一種簡便、適用的鑒定評估RNA完整性的方法，通過凝膠圖像可判斷RNA有無降解以及降解程度。從圖2可見，采用1%瓊脂糖凝膠電泳，M8未見明顯條帶，效果不佳；M3、M6和M7提取的RNA條帶較弱，濃度低，可能在提取或者電泳過程中RNA發生了部分降解；其余提取方法均顯示出較為明顯的條帶，其中M1提取的RNA條帶亮度較高，但條帶較為彌散不清晰且具有拖帶現象，存在蛋白和多糖污染情況，可能由于樣品中多糖多酚含量較高，提取液中CTAB未能將其全部聚合形成復合物沉淀從而未與核酸更好地分離；M2和M4方法條帶較為清晰，盡管M2提取的RNA中28S和18S條帶明暗差距更為明顯，但是M4提取的RNA中28S條帶亮度明顯高于18S；M5方法條帶清楚且無拖帶，重復性也較好。因此，比較8種提取方法，M4、M5提取的RNA完整性較好。

2.2 總RNA濃度與純度的檢測

高質量RNA的A260nm/A280nm應介于1.8~2.0之間，A260nm/A230nm應大于2.0。通過Nano Drop 2000核酸蛋白檢測儀對8種方法提取鐵皮石斛花的總RNA進行濃度和純度檢測(表1), M4方法所得的總RNA濃度最高，為(199.31±5.68) ng/μL；M5的次之[(142.30±4.66) ng/μL]；M2、M3、M6、M7的為(46.42±4.84)~(66.37±2.47) ng/μL，效果一般；M8的僅為(16.20±1.23) ng/μL，無法滿足后續試驗要求。除M2、M6、M8提取的總RNA的A260nm/A280nm不符合要求外，其余方法均在1.8~2.0之間，M1、M6提取的總RNA的A260nm/A230nm低于2.0，其余方法的均高于2.0，說明樣品中來自蛋白、酚類、糖類等的污染較少，提取的RNA質量較為可靠。因此，M4和M5是最優的2種方法。

2.3 內參基因的RT-PCR擴增

圖2 8種方法提取鐵皮石斛花朵總RNA的電泳圖。M: DNA marker; M1: 改良CTAB-LiCl法; M2: 改良CTAB-異丙醇法; M3: 改良SDS-LiCl法; M4:改良SDS-異丙醇法; M5: 多糖多酚植物RNA提取試劑盒法; M6: 柱式植物RNAout 2.0試劑盒法; M7: RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒法; M8: Biospin多糖多酚植物總RNA提取試劑盒法。Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of total RNA extracted by eight different protocols from Dendrobium officinale flowers. M: DL2000 marker; M1: Improved CTAB-LiCl method; M2: Improved CTAB-isopropanol method; M3: Improved SDS-LiCl method; M4: Improved SDS-isopropanol method; M5: Quick RNA Isolation Kit; M6: Column Plant RNAout 2.0; M7: RNAprep Pure Plant Plus Kit; M8: Plant Total RNA Extraction Kit.

表1 8種方法提取的鐵皮石斛花RNA的濃度、純度和產率Table 1 Yield, purity and concentration of total RNA extracted by using eight different protocols from Dendrobium officinale flowers

為進一步驗證所提取RNA的完整性，使用Promega公司的M-MLV反轉錄試劑盒, 將M4、M5方法提取的RNA進行反轉錄，以cDNA第一條鏈為模板設計鐵皮石斛內參基因Actin (NCBI登錄號:JX294908)的特異性引物進行擴增，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖3), 可見，兩種方法提取的RNA, 經反轉錄后PCR擴增產物片段均為250~500 bp，與預期目的片段390 bp相符，且條帶清晰、單一，亮度較高，說明SDS-異丙醇法(M4)和華越洋試劑盒法(M5)均能用于RT-PCR反應等以RNA為基礎的分子生物學研究分析。

2.4 石斛屬植物RNA的提取

圖3 鐵皮石斛Actin基因的RT-PCR電泳圖。M: DNA marker; M4: 改良SDS-異丙醇法; M5: 多糖多酚植物RNA提取試劑盒法。Fig. 3 Agarose gel electrophoresis of Actin gene from Dendrobium officinale.M: DL2000 marker; M4: Improved SDS-isopropanol method; M5: Quick RNA Isolation Kit.

采用M4和M5對4種常見的石斛屬植物(霍山石斛、金釵石斛、鼓槌石斛、美花石斛)進行總RNA提取(圖4)。兩種方法提取的RNA，經1%瓊脂糖凝膠電泳均得到清晰無彌散的條帶，說明蛋白質、酚類、糖類等雜質去除效果較好，所得RNA的A260nm/A280nm介于1.8~2.0之間，A260nm/A230nm大于2.0，且RNA濃度均高于100 ng/μL。因此, M4和M5方法能夠提取出高質量、符合要求的霍山石斛、金釵石斛、鼓槌石斛、美花石斛花中的總RNA，也可為蘭科石斛屬其他植物花的RNA提取提供參考。

圖4 4種石斛屬植物花的總RNA電泳圖。A: M4; B: M5; M: DNA marker; 1: 鼓槌石斛; 2: 霍山石斛; 3: 金釵石斛; 4: 美花石斛。Fig. 4 Gel electrophoresis of flower total RNA from four Dendrobium plants. A: M4; B: M5; 1: D. chrysotoxum; 2: D. huoshanense; 3: D. nobile; 4: D.loddigesii.

3 結論和討論

無論是關鍵基因克隆、Real-Time PCR分析, 還是高通量測序等分子生物學研究，獲取純度高、完整性好、濃度高的RNA是研究開展的前提。石斛屬植物花朵在生長過程中會大量富集揮發油、多酚類、花色素和黃酮類等多種次生代謝產物以及蛋白質和多糖等有機大分子[7-12,14]。其中，多酚類物質易氧化成醌，與RNA發生不可逆結合，在有機溶劑抽提過程中會與部分RNA結合而流失[20,22]，影響RNA提取產率。多糖與RNA的理化性質相似,在沉淀RNA過程中易形成黏膠狀沉淀，導致所得RNA難溶于水，或溶解后溶液粘稠[17,20-22]，RNA產率降低，此外，多糖可以抑制下游酶的反應活性[17-18]，被污染的RNA難以進行后續的分子生物學研究。因此，在石斛屬植物(鐵皮石斛)花朵的總RNA提取過程中，有效去除DNA、蛋白質和多糖、多酚等次生代謝產物干擾，抑制RNA酶活性是提取純度高、完整性好、濃度大RNA的關鍵所在。

本研究采用改良SDS-異丙醇法(M4)以SDS、高濃度NaCl和β-巰基乙醇作為RNA抽提液的主要成分，經過水飽和酚、氯仿/異戊醇抽提，將絕大多數多糖、酚類物質留在有機相，再經異丙醇低溫孵育，從而獲得完整性好、純度高的RNA。其中，SDS是一種陰離子表面活性劑，使蛋白質變性，細胞膜裂解，讓核酸溶解于裂解液中，與β-巰基乙醇共同作用抑制RNA酶和DNA酶活性[17,24]。水飽和酚使蛋白質變性，也抑制了RNA酶的降解作用。氯仿抽提加速水相與有機相分層，去除核酸溶液中的跡量酚[15,22]。相比較M3，M4提取鐵皮石斛花朵的RNA濃度、純度都較高，主要原因可能是LiCl在與RNA反應的同時，也可能與多糖、多酚類物質結合沉淀，導致RNA部分流失。

前人研究表明，試劑盒具操作簡便、提取時間短的優勢，可用于多糖多酚含量高的植物總RNA提取。M5對菊花根尖[25]和花瓣[26]、M6對鐵皮石斛莖和葉[23]的總RNA提取效果較好。本研究比較了4種試劑盒(M5、M6、M7、M8)提取鐵皮石斛花總RNA的效果，僅M5可獲得完整性好、純度高的RNA。M6、M7、M8提取的效果較差，這可能是因為鐵皮石斛花富含多糖、黃酮、多酚等物質,在RNA提取過程中通過濾膜難于將雜質與核酸分離，易使小分子RNA丟失，導致總RNA濃度降低。此外，M5提取鐵皮石斛花RNA的過程中，適當延長孵育時間可以增加RNA裂解液與植物細胞接觸,促進細胞充分裂解、釋放RNA。

綜上所述，改良SDS-異丙醇法(M4)、多糖多酚植物RNA提取試劑盒(M5)能有效從石斛屬植物(鐵皮石斛、鼓槌石斛、霍山石斛、金釵石斛、美花石斛)花朵中提取純度較高、完整性較好的RNA, 所提取的總RNA的A260nm/A280nm為1.8~2.0，A260nm/A230nm大于2.0，電泳的28S、18S條帶清晰。Realtime PCR結果表明，M4和M5提取的總RNA純化后可用于鐵皮石斛花香合成的關鍵酶基因克隆等后續的分子生物學試驗。本研究結果可為富含多糖、黃酮、花色素、多酚類物質的其他植物材料的RNA提取提供參考。