云南巍山地區廣義蟲草的物種多樣性研究

趙志遠, 王元兵, 王志勤, 湯德相, 耿宇鵬, 虞泓*

(1. 云南大學生態與環境學院, 昆明 650091; 2. 云南大學-中國(云南)東南亞蟲草生物資源可持續利用國際聯合研究中心, 昆明 650091)

廣義蟲草(Cordycepssensu lato)，是肉座菌目(Hypocreales)真菌寄生在無脊椎動物、少數真菌和黏菌等的總稱。蟲草是重要的藥用和生物防治資源，對保健產品開發和農林有害昆蟲調節有重要作用。冬蟲夏草(Ophiocordyceps sinensis)、蛹蟲草(Cordyceps militaris)和蟬花蟲草(C. cicadae)等含有多種生物活性成分，如蟲草酸、多糖、腺苷等，對抗氧化、抗腫瘤、潤肺、提高免疫力和降血糖血脂有明顯功效，具有重要的藥用價值[1]。在生物防治研究中，球孢白僵菌(Beauveria bassiana)、布氏白僵菌(B. brongniartii)等白僵菌屬物種對生態系統節肢動物種群調節和穩定有重要作用[2]。自然界中蟲草種類繁多，我國更是具有豐富和獨特的蟲草資源，據不完全統計，全球已報道的蟲草種類約有100屬800余種，其中我國約有40多屬400余種[3]。作為世界上12個生物多樣性豐富的國家之一，蟲草資源的調查對豐富我國真菌多樣性具有重要意義[4]。前期，宋斌等[5]對滇黔桂蟲草資源多樣性進行了初步調查，發現52種蟲草，表明中國是蟲草的一個分布中心。唐保宏等[6]整理報道了河南省的10種蟲草資源，并提出開發和保護建議。彭凡等[7]報道安徽萬佛山地區6種蟲草資源，其中1種為中國新記錄。蟲草的分布與地理位置、氣候和植被類型等環境因素有很大關系，因此對不同地區蟲草進行物種多樣性研究，可以更好地了解不同生態系統中蟲草物種分布格局。目前，有關蟲草的開發應用正在深入展開，對蟲草資源進行廣布性調查，明確各地區蟲草物種名錄，可以為保護與合理開發利用蟲草資源提供基礎信息，為有害昆蟲生物防治提供理論依據。

大理白族自治州位于云南省中西部，平均海拔2 090 m，主要以山地為主，地勢西北高、東南低。全年溫差較小，四季如春，年均降雨量約1 053 mm，四季干濕分明[8]。巍山彝族回族自治縣位于大理白族自治州的西南部，地處哀牢山和無量山的北部,是瀾滄江和紅河兩大水系的分水嶺，并且具有縱貫巍山壩子的西河為國際河流——紅河的源頭。巍山地區屬亞熱帶季風氣候類型，年均溫為15.7℃, 降雨量約812.6 mm[9-10]。因其獨特的地形地貌、全年溫和的氣候條件以及茂密的天然森林植被，為該地區真菌資源的形成提供了良好的地理優勢和生態環境，因此巍山地區勢必擁有豐富的蟲草物種多樣性。

本研究于2019年7-9月分別在巍山地區東、西、南、北和中部設置樣地進行蟲草的資源調查,通過形態觀察及多基因系統發育分析鑒定物種,采用α多樣性和物種相對頻率分析探討該地區蟲草物種多樣性，基于物種累計曲線預測巍山地區蟲草豐富度，以期了解該地區蟲草物種多樣性和分布特點, 為蟲草資源的保護和可持續利用提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 試驗區概況

巍山彝族回族自治縣位于云南省西部，地處99°55′~100°25′ E，24°56′~25°32′ N。全縣面積2 183.01 km2，山地面積占全縣的94%，具有豐富的森林植被資源。巍山地區森林多為天然林，以針葉林和針闊混交林為主，多為云南松(Pinus yunnanensis)和櫟樹(Quercus linn)、冬瓜樹(Alnus cremastogyne)、核桃(Juglans regia)、高山榕(Ficus altissima)和華山松(Pinus armandii)組成[11]。

1.2 方法

標本采集2019年7-9月分別在巍山地區東、西、南、北和中部的巍寶山、紫金山、小雞足山、紅河源和衛東林場采集蟲草標本。蟲草通常生長在林中灌木叢下、枯枝落葉層或樹葉背面等環境濕度較高的地方，采用沿路踏查、普查等方式，在適宜蟲草生長的小生境下采集。采集的標本用脫脂棉包好，放入滅菌的收集管和密封袋保鮮，于4℃冰箱內保存。

菌株分離參見梁宗琦等[12]和王元兵等[13]的方法，采取子囊孢子分離法、組織分離法和表面消毒法進行菌種分離。所有蟲草標本均保存在云百草標本館(YHH)，純化分離菌株均保存于云南真菌培養物保存中心(YFCC)。

物種培養和鑒定使用PDA培養基在25℃下培養蟲草，采取形態觀察和多基因(nrSSU、nrLSU、EF-1α、RPB1和RPB2)系統發育分析的方法[14-15],鑒定采集物種。形態觀察包括寄主的種類、有性型和無性型等特征。采用CTAB法提取成熟菌絲的總DNA對5個基因片段進行PCR擴增后，用1%瓊脂糖膠進行電泳檢測，將條帶明亮且無雜帶的樣品送至鉑尚生物技術(上海)有限公司進行測序。根據已有研究[16-20]，在GenBank數據庫中檢索并下載蟲草的5個基因序列，對單個基因數據矩陣序列進行比對，N表示缺失的片段，最后將5個基因數據矩陣序列進行拼接整合，以Trichoderma deliquescens和T. deliquescens作為外類群，用RAxML軟件進行多基因系統發育分析, 構建系統發育樹(最大似然樹),確定各物種的分類地位，最后選取每種物種的代表性菌株顯示在系統發育樹上。

物種多樣性分析基于α多樣性分析研究樣地內蟲草真菌數量特征，物種豐富度指數、多樣性指數、均勻度指數和優勢度指數，用RStudio的Vegan軟件包進行統計分析[21-23]。相對頻率(relative frequency, RF)指巍山地區采集的某種蟲草物種數占該地區蟲草總數的百分比。相似性系數(similarity coefficient, Cs)采用Sorenson公式計算：Cs=2j/(a+b)，式中，j指兩樣地間共有的蟲草物種數，a指一個樣地的蟲草物種數，b指另一樣地的蟲草物種數目[24]。利用EstimateS軟件計算和分析ACE指數和Bootstrap指數，以獲得物種期望豐富度(S)。通過Excel繪制巍山地區蟲草的物種累計曲線(species accumulation curve)。

2 結果和分析

2.1 蟲草物種鑒定

本次調查共采集蟲草341株，初步鑒定巍山地區有20種蟲草，隸屬于2科5屬，分別是蟲草科(Cordycipitaceae)的蟲草屬(Cordyceps)、白僵菌屬、Samsoniella和線蟲草科(Ophiocordycipitaceae)的線蟲草屬(Ophiocordyceps)和多頭霉屬(Polycephalomyces)。其中有7種為疑似新物種，隸屬于2科4屬, 其中，2種蟲草屬、2種Samsoniella、1種多頭霉屬和2種線蟲草屬(表1, 圖1)。

表1 巍山地區調查樣地信息Table 1 Investigate plots in Weishan County

2.2 蟲草分布特征

巍山地區采集到341株蟲草，分別鑒定為13種已知種和7種疑似新物種，其中巍寶山9種(73株)，占該地區總數的21.4%；紫金山8種(53株), 占15.5%；小雞足山9種(25株)，占7.3%；紅河源13種(125株)，占36.7%；衛東林場8種(61株)，占17.9%。只有細腳蟲草(C. tenuipes)和球孢白僵菌在5個樣地均有分布。基于物種豐富度指數、Berger-Parker 優勢度、Shannon-Wiener多樣性指數、Pielou均勻度指數分析巍山地區東、西、南、北和中部5個樣地的蟲草物種多樣性表明，該地區蟲草物種多樣性較高，優勢種屬現象較為明顯，優勢屬為蟲草屬(優勢度為0.63，共采集215株)，優勢種為蛹蟲草(生態優勢度為0.27，共采集了93株)，蟲草寄主涉及鱗翅目、鞘翅目、膜翅目和半翅目昆蟲，主要是鱗翅目。對各樣地蟲草物種多樣性的分析表明,北部的紅河源樣地蟲草物種多樣性較高(Shannonwiener指數為1.76，物種豐富度為13種)，多樣性最低的是南部的小雞足山(Shannon-wiener指數為1.60，物種豐富度為9種)。

用物種相似性系數(Cs)來比較巍山地區不同樣地間的蟲草物種組成的相似度。從表3可見，巍山地區5個樣地中，紅河源樣地與其他樣地的相似度最高，為0.38~0.64；巍寶山樣地與紅河源樣地的物種相似度最高，Cs達0.64；小雞足山與紫金山樣地、巍寶山與衛東林場樣地的蟲草物種組成最為接近, Cs為0.58；而小雞足山與衛東林場樣地的Cs最低，為0.24。

2.3 蟲草物種累計曲線

物種累計曲線是描述隨抽樣數量增多而增加物種數量的模型，是調查研究樣地物種組成和預測物種豐度的理想工具[25]。本研究基于巍山東、西、南、北和中部5個研究樣地蟲草的物種分布數據，利用EstimateS軟件計算和分析了巍山地區蟲草多樣性,繪制了巍山蟲草物種累計曲線。

根據物種累計曲線圖和EstimateS軟件計算,ACE值和Bootstrap值分別為21.16和22.72，表明該地區蟲草豐富度約為21~23種，估計本次研究已經調查了巍山地區86.96%~95.24%的蟲草。

3 結論和討論

圖1 基于5個基因(nrSSU、 nrLSU、EF-1α、RPB1和RPB2)構建的巍山地區蟲草系統發育樹。*: 采自巍山地區。Fig. 1 Phylogenetic tree of Cordyceps sensu lato from the Weishan country constructed by the analysis of five-locus (nrSSU, nrLSU, EF-1α, RPB1 and RPB2)dataset. *: Collected from Weishan area.

表2 蟲草標本統計Table 2 Statistics of Cordyceps sensu lato specimens

表3 巍山地區的蟲草物種多樣性指數Table 3 Diversity indexes of Cordyceps sensu lato in Weishan County

圖2 巍山地區的蟲草物種累計曲線Fig. 2 Species accumulation curve of Cordyceps sensu lato in Weishan County

本研究結果表明，巍山地區擁有豐富且獨特的蟲草資源，其蟲草物種多樣性較高，物種豐富度較大。本次調查的采樣范圍涉及巍山地區的東、南、西、北和中部5個樣地，包括未被人類活動干擾的樣地以及已被開發的自然保護區樣地，以期更詳細探明巍山地區蟲草的數量及種類。本次調查共采集蟲草341株，鑒定出20種蟲草，其中有7種疑似新物種，分別隸屬于蟲草科的蟲草屬、Samsoniella以及線蟲草科的多頭霉屬和線蟲草屬。

本次研究表明，巍山地區北部紅河源樣地具有較高的蟲草物種多樣性，南部的小雞足山的蟲草物種多樣性較低，推測可能與巍山地勢北高南低且海拔懸殊較大，中部被山脈阻隔劃分為不同水系導致南北部森林植被不同有關。此外，物種多樣性最高的紅河源樣地森林植被覆蓋良好且物種豐富，山間流淌溪流，空氣濕度大且昆蟲種類豐富，因而造就了該地區獨特和豐富的蟲草多樣性。小雞足山山間種植許多的經濟作物且山頂有祭祀等活動，人類干擾較大，空氣濕度相對較低，昆蟲種類及豐度不大,因而該地區的蟲草物種多樣性相對較低。因此蟲草更適宜生活在人為干擾較低、氣候條件優越、且生物多樣性較高的自然生態系統內[26]。

表4 巍山樣地間的蟲草物種相似性系數Table 4 Similarity coefficient (Cs) of Cordyceps sensu lato among plots in Weishan County

巍山地區蟲草資源優勢種屬現象明顯，優勢屬為蟲草屬，優勢種為蛹蟲草，占菌株總數的27%。蛹蟲草為世界廣布種，分布于熱帶、亞熱帶和溫帶地區，具有較寬的生態位，對森林生態系統的昆蟲群落數量的穩定具有重要作用。此外，蛹蟲草藥食同源，具有卓越的醫藥用途和保健價值，含有多種活性成分，其在免疫調節、抑菌、抗腫瘤和抗病毒上具有重要的藥理作用，廣泛應用于醫藥、食品和保健品中。前期研究表明，蛹蟲草發生與生態環境因子的綜合作用有密切關系，主要影響因子包括溫濕度、植被類型、寄主昆蟲以及土壤質地等[27]，不同生境下蛹蟲草變異式樣差異較大，主要包括子座大小與子囊大小以及著生方式上的區別[28-29]。本次調查不同生境樣地中，紅河源樣地的蛹蟲草豐富度最高，但形態比其他樣地較小，子座相對較短, 可能是該樣地蟲草物種多樣性較高，寄主鱗翅目蛹昆蟲在較小時便被感染，其營養物質不足以長出粗長的子座，導致該地區蛹蟲草形態較小，但豐富度很高。

巍山地區北部紅河源樣地與東部巍寶山樣地的蟲草物種相似度最高，相似系數為0.64，表明兩樣地的蟲草物種最為相似；南部小雞足山與中部衛東林場樣地物種相似系數為0.24，表明兩地的物種相似度最低。可能地理隔離的因素更能決定蟲草的分布和物種組成的相似性，可以為日后對野外蟲草調查提供參考。

巍山地區的蟲草資源調查豐富了大理州乃至云南省的蟲草物種資源庫，同時為云南省及國內其他地區的蟲草資源調查奠定了一定基礎[30]。本次調查基本弄清該地區的蟲草物種種類，對當地的蟲草資源保護和可持續利用提供了理論依據。由于本次調查研究的取樣范圍以及采集到的蟲草標本有限，調查到的蟲草資源物種主要涉及蟲草科和線蟲草科物種，對于未調查到的麥角菌科物種在日后對于滇中西部地區的真菌資源調查研究中尚需加強關注。