枇杷果肉總多酚提取及體外抗氧化活性研究

湯承浩

枇杷果肉總多酚提取及體外抗氧化活性研究

湯承浩1,2

（1. 凱里學院大健康學院, 貴州 凱里 556011; 2. 貴州省普通高等學校黔東南民族藥綜合利用工程技術研究中心，貴州 凱里 556011）

目的：以枇杷果肉為研究對象，輔以超聲波法提取總多酚。方法：通過正交試驗確定最優提取工藝條件：提取溫度為60 ℃，料液比1∶35（g·mL-1），乙醇體積分數60%，超聲提取時間18 min，總多酚提取率達0.94%。通過1, 1-二苯基-2-苦肼基（DPPH·）清除率的測定對枇杷果肉總多酚進行體外抗氧化活性評價。結果：枇杷果肉總多酚DPPH·清除率明顯高于維生素C（Vc），且枇杷果肉總多酚 DPPH·半數抑制濃度（IC50=7.04 μg·mL-1）優于Vc（IC50=7.70 μg·mL-1）。結論：枇杷果肉總多酚是一種天然的抗氧化活性劑。

枇杷果肉； 總多酚； 提取工藝； 抗氧化活性

植物多酚的提取方法較多，主要包括超臨界CO2萃取法[1]、超聲波輔助提取[2]、超聲協同酶法提取[3]、酶法輔助提取[4]、微波協同輔助提取法[5]、回流提取法[6]等，且由于超聲波產生的機械振動能夠快速、高效的破壞組織細胞結構，故而有利于加速多酚的提取，同時也可避免使用高溫對多酚的毀壞[7]，因此，超聲波提取法被廣泛應用于植物多酚的提取。

近來，大多數研究人員主要對枇杷葉中熊果酸、齊墩果酸揮發油和β-葡萄糖苷酶[8-9]以及枇杷核中的總黃酮和總多酚[10-11]等部分進行提取研究，對枇杷果肉總多酚的提取工藝及其體外抗氧化活性研究目前少有報道。因此，本文采用L9（33）正交試驗對枇杷果肉總多酚的超聲輔助提取工藝進行優化，并采用DPPH·清除率來評價其抗氧化活性，為枇杷果肉多酚類化合物的綜合開發利用提供重要依據。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

枇杷采自麻江縣下司鎮，經植物學博士鑒定為定為薔薇科植物枇杷(Thunb.) Lindl.的成熟果實。枇杷果肉樣品于50oC 鼓風干燥箱中干燥，再用小型植物粉碎機粉碎并過100目（150μm）篩，待用。DPPH、三氯乙酸、沒食子酸和Folin﹠ciocalteu’s酚試劑均由上海阿拉丁生化有限公司提供；紫外-可見分光光度計（日本島津UV-2550型）；粉碎機（科偉永興儀器有限公司FW200型）；水浴振蕩器（予華儀器有限公司SHA-C型）；超聲波清洗器（上海科導儀器有限公司SK2510LHC型）；電子天平（奧豪斯儀器有限公司AR224CN型）。

1.2 試驗方法

1.2.1 枇杷果肉總多酚的提取

取新鮮枇杷果肉洗凈切片，50oC干燥。稱取1 g粉碎過100目（150μm）篩的枇杷果肉，加入20 mL 體積分數為70%的乙醇溶液，270 W超聲條件下60oC水浴提取14 min，離心，取上清液用蒸餾水定容至50 mL，取0.7 mL于50 mL量瓶中加12 mL蒸餾水，搖勻，加1 mL Folin-Ciocalteu（FC）試劑和4 mL 體積分數為10%的Na2CO3溶液，蒸餾水定容，避光2 h，測定總多酚提取率。通過改變溶劑濃度、料液比和提取時間等因素來探討溶劑回流法提取生姜多酚的工藝條件。

式中：—多酚質量濃度。

1.2.2 枇杷果肉總多酚的測定

精確稱量0.010 0 g沒食子定容至100 mL。分別取該溶液0、0. 5、1.0、1. 5、2.0、2.5 mL于6個25 mL容量瓶中，加6.0 mL超純水，搖勻，再加入0.5 mL FC試劑，加入2.0 mL 體積分數為10％的Na2C03溶液，用超純水定容。避光2 h后于760 nm波長下測定吸光度，平行此操作3次后取平均值。以沒食子酸濃度（）為橫坐標，吸光度（）為縱坐標，繪制標準曲線。線性回歸得標準曲線方程：

= 72.5+ 0.111 2，相關系數2 = 0.999 8。

在沒食子酸質量濃度為2～10 μg·mL-1范圍內該方法線性關系良好。

1.2.3 單因素試驗設計

考察乙醇體積分數、提取時間和液料比等3個單因素的影響。

1）乙醇體積分數分別采用30%、40%、50%、60%、70%和80%的條件下進行比較，超聲時間14 min，料液比1∶20（g∶mL）；

2）超聲時間采用6、10、14、18、22和26 min的條件下進行比較，乙醇體積分數60%；

3）料液比采用1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40（g∶mL）的條件下進行比較，超聲時間為18 min，乙醇體積分數為60%，從而確定料液比的影響。

1.2.4 正交試驗設計

根據單因素試驗結果，選擇乙醇體積分數、提取時間和料液比進行3因素3水平做L9（33）正交試驗優化提取條件，因素水平設計見表１。

表1 正交試驗因素與水平

1.2.5 清除DPPH·能力試驗

將超聲輔助提取的枇杷果肉總多酚溶液分別配制成0.001 8、0.003 6、0.005 4、0.007 2、0.009 0 mg·mL-15種不同質量濃度。向2.0 mL DPPH乙醇溶液（0.08 mg·mL-1）中分別加2.0 mL不同質量濃度的枇杷果肉總多酚溶液，混合反應30 min，并用紫外-可見分光光度計（517 nm）測其吸光度，記為Ai；同時測2.0 mL DPPH乙醇溶液（0.08 mg·mL-1）與2.0無水乙醇混合液的吸光度，記為Ao。以維生素Ｃ為陽性對照，枇杷果肉總多酚對DPPH·清除率計算公式為：

2 結果與分析

2.1 乙醇體積分數對枇杷果肉多酚提取影響

由圖1分析可知，在乙醇體積分數為30%~60%范圍內，隨乙醇體積分數的增大總多酚提取率增大，當乙醇體積分數達到60%時，總多酚得率最大（9.5375 mg·g-1），之后隨乙醇體積分數增大，提取率反而呈下降趨勢。因此，選取乙醇體積分數50%、60％、70%３個水平作為正交試驗。

圖1 乙醇體積分數對枇杷果肉總多酚提取效果的影響

2.2 超聲時間對枇杷果肉多酚提取效果的影響

由圖2可知，隨著超聲時間的加長，枇杷果肉總多酚提取率逐漸升高，當超聲時間為18 min時，多酚得率為9.6950 mg·g-1，達最大值；之后超聲時間延長，總多酚提取率下降。因此，選取超聲時間14、18、22 min３個水平繼續正交試驗。

圖2 超聲時間對枇杷果肉總多酚提取效果的影響

2.3 料液比對枇杷果肉多酚提取效果的影響

由圖3可知，溶劑用量的不斷增加，枇杷果肉中總多酚提取率提高，當料液比在1∶35（g·mL-1）時多酚得率最大，為9.992 5 mg·g-1，但隨著溶劑用量的進一步增加，枇杷果肉總多酚提取率呈下降趨勢。 因此，選取料液比1∶30、1∶35和1∶40（g·mL-1）３個水平進行正交試驗。

圖3 料液比對枇杷果肉總多酚提取效果的影響

2.4 枇杷果肉總多酚最優提取工藝的確定

采用表2的L9（33）因素水平進行正交試驗，以枇杷果肉總多酚提取率為指標。從表2分析可知，枇杷果肉總多酚提取率的影響因素由大到小為料液比＞超聲時間＞乙醇體積分數。枇杷果肉總多酚最優提取因素水平組合為A2B2C2，即料液比1∶35（g·mL-1）、超聲時間18 min、乙醇體積分數60%。

表2 對枇杷果肉總多酚提取率的影響因素正交試驗結果

2.5 驗證性實驗

在最佳提取工藝條件下（溫度60oC、料液比1∶35（g·mL-1）、超聲時間18 min、乙醇體積分數60%），用相同方法提取５個樣品，測定多酚提取率分別為0.941 2%、0.942 4%、0.943 1%、0.945 3%和0.947 0%，平均提取率為0.943 8%，RSD值為0.25%，表明該最佳提取工藝穩定可靠。

2.6 枇杷果肉總多酚清除DPPH·能力評價

從圖4可以看出，枇杷果肉總多酚質量濃度的提高，清除DPPH·的能力逐步增強，即清除率與總多酚的質量濃度間存在較明顯的量效關系。當總多酚質量濃度小于0.009 mg·mL-1時，枇杷果肉總多酚的DPPH·的清除率優于對照品Vc。由插值法可得其清除DPPH·自由基的 IC50為7.04 μg·mL-1，稍大于Vc的IC50值7.70μg·mL-1，表明枇杷果肉總多酚可作為天然抗氧化劑使用。

圖4 枇杷果肉總多酚對DPPH·清除作用

3 結論與討論

本試驗以枇杷果肉為原料，采用超聲輔助提取法，通過單因素試驗及正交試驗討論了枇杷果肉總多酚提取工藝條件，并確定最佳提取工藝為：提取溫度為60oC，料液比1∶35（g·mL-1），乙醇體積分數60%，超聲提取時間18 min，枇杷果肉總多酚提取率達0.943 7%。在該實驗條件下進行驗證性試驗，重復5次，平均提取率為0.943 8%，RSD值為0.25%，表明該工藝具有提取率高，且穩定可靠等優點。抗氧化實驗表明，枇杷果肉總多酚具有一定的清除DPPH·自由基的能力，且IC50值大于Vc的IC50值，表現出了較好的抗氧化活性。

在一定范圍內，隨著乙醇體積分數的增大，多酚的溶出量不斷增加，這可能是醇溶性物質的溶出量隨著乙醇體積分數的逐漸增大而增加，提取率呈增大趨勢；但乙醇體積分數過大亦可導致枇杷果肉中的某些脂溶性物質溶出量不斷增大，這些物質可與多酚類物質形成競爭關系，影響枇杷果肉多酚類物質的溶出。當超聲提取時間較短時，總多酚提取量隨超聲提取時間增加而增大，但是當超聲提取時間超過18 min時，枇杷果肉總多酚提取量反而下降，這可能是超聲時間過長后，其具有的較強機械效應與熱效應，使多酚類物質發生變質。

本研究結果表明，利用超聲輔助方法提取枇杷果肉多酚類化合物具有提取率高、重現性好、多酚類物質結構穩定等優點，該法所得多酚類化合物具有較強的抗氧化生物活性，為枇杷果肉的綜合開發利用和尋找高效的天然抗氧化劑提供科學的依據。

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Extraction of Total Polyphenols Fromand Its Antioxidant Activity in Vitro

1,2

（1. School of Life and Health Science, Kaili University, Kaili Guizhou 556011, China; 2. Qiandongnan Engineering and Technology Research Center for Comprehensive Utilization of National Medicine,Kaili Guizhou 556011, China）

Objective: To extract total polyphenols fromby ultrasonic method. Methods: The optimum extraction conditions were determined by orthogonal test: extraction temperature 60 ℃, solid-liquid ratio 1∶35 (g·mL-1), ethanol volume fraction 60%, ultrasonic extraction time 18 min. Under above conditions, the extraction rate of total polyphenols was 0.94%. The antioxidant activity of total polyphenols fromwas evaluated by the determination of DPPH· scavenging rate. Results: DPPH· scavenging rate of total polyphenols inwas significantly higher than that of vitamin C (VC), and DPPH· 50 (IC50= 7.04 μg·mL-1) was better than VC(IC50 = 7.70 μg·mL-1). Conclusion: The total polyphenols inis a natural antioxidant.

; Total polyphenols；Ultrasonic extraction；Antioxidant activity

凱里學院2015年度科技合作協議項目（黔科合HL字[2015]7745號）資助。

2020-08-10

湯承浩（1986-），男，江蘇省連云港市人，講師，碩士研究生，2014年畢業于貴州大學農藥學專業，研究方向：藥物合成及活性研究。

R284.1

A

1004-0935（2020）09-1055-04