hTERC 基因檢測與HC2、SPR 技術檢測HPV在宮頸病變中的診斷價值

廖 婧，許長俊，孫春意，潘 景，周紅林，劉 洋

（1）昆明醫科大學第二附屬醫院婦科，云南昆明 650101；2）玉溪市人民醫院生殖醫學科，云南玉溪653100，3）昆明醫科大學第二附屬醫院生殖醫學科，云南昆明 650101）

宮頸癌（cervical cancer，CC）是女性患者發病率較高的生殖道惡性腫瘤之一，據統計，2018年全世界CC 發病率為3.2%[1]，我國發病率也高達3.6%[2]，嚴重損害全球婦女的身心健康，其主要由高危人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）持續感染引起[3]。但絕非所有的HPV 感染都可進展至癌前病變及宮頸癌，據統計有超過一半的HPV感染患者可通過自身免疫清除感染，CC 發病率要顯著低于HPV 感染率，因此推測還有其他因素參與共同導致CC 發生[4]。現很多國內外學者[5-6]發現，在各級宮頸病變中幾乎都伴有人端粒酶基因（human telomerase componentgene，hTERC）的過度表達，表明其在宮頸惡性腫瘤的發生、發展過程中發揮關鍵作用，可作為宮頸病變明確診斷和評估預后的標志物。

本研究分別采用雜交捕獲II（hybrid captureⅡ，HC2）和等離子諧振法（surface plasmon resonance SPR）檢測HPV 感染情況，同時用熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH）法來獲取不同宮頸組織中hTERC 基因的表達情況，從而探討宮頸病變初期普通篩查中hTERC 基因與高風險類型HPV 感染的關系，為CC 早期診斷、治療提供良好決策。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究已通過醫院倫理審查委員會審查。研究對象為1 200 名于昆明醫科大學附屬第二醫院婦科就診且行宮頸篩查的患者，所有患者均為有性生活史且排除妊娠，無宮頸治療史、放化療史及嚴重內科疾病。所有標本均進行SPR-HPV、HC2-HPV 及hTERC 基因三項檢測，其中一項結果提示為陽性的患者行陰道鏡檢查下宮頸活檢，以病理學結果作為分組標準，有150 名患者行病理組織檢查，將其分為4 組，即正常組32 例，CINI組38 例，CIN II-CIN III 組66 例，宮頸癌組14例。

1.2 研究方法

1.2.1 標本采集及實驗步驟 將細胞采集刷、HPV 采樣刷先后放入宮頸口，單向旋轉3～5 圈后取出，把刷頭置于保存液內，標記后送檢。HC2技術的主要步驟：細胞的裂解、細胞的雜交、捕獲、信號的擴大及信號的檢測。SPR 技術的主要步驟：DNA 提取純化、PCR 擴增、擴增產物基因型檢測。FISH 檢測：主要參照相關操作指南進行，包括：制作玻璃載片、預處理及標本變性雜交、制備玻片的洗滌及復染。

1.2.2 結果判讀 如果含有3 個及以上紅色信號的細胞核在100 個信號完整細胞核中的百分比超過規定閾值（本研究閾值為6.2%），則歸類為hTERC 基因陽性，表示基因有擴增。HC2-HPV 技術屬于半定量檢測，若HR-HPV 負荷量≥1.0pg/mL 則為HC2-HPV 陽性。SPR-HPV 檢測結果則由計算機自動解釋。

1.3 統計學處理

實驗數據用SPSS 軟件包分析，計數資料采用例數及百分比表示，計量資料用χ2檢驗和秩相關性分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 病理學檢測中hTERC 基因表達與宮頸病變的關系

宮頸病變級別不同，hTERC 基因表達情況存在顯著差異（χ2=28.90，P=0.000），且隨著宮頸病變程度的加重，hTERC 基因有擴增趨勢，見表1。

2.2 hTERC 基因表達與HPV 感染的關聯性

在正常組、CINⅠ、CINⅡ/CINⅢ、CC 組病變程度依次增加的情況下，hTERC 基因的異常擴增和HC2-HPV、SPR-HPV 的陽性率之間存在相關性聯系（r1=0.538，P1=0.000；r2=0.796，P2=0.000），見表2，提示隨著宮頸病變的升級，不僅有HPV 感染率的上升，hTERC 基因的表達率也在逐步增加。

表1 150 例患者hTERC 基因表達情況與病理分級Tab.1 hTERC gene expressions and pathological grades in 150 patients

表2 兩種檢測方法檢測HPV 情況和hTERC 陽性表達的關系［n（%）］Tab.2 Relationship between HPV status and positive expression of hTERC detected by the two detection methods ［n（%）］

2.3 hTERC 基因在HC2-HPV、SPR-HPV 組別中的表達差異

在HC2-HPV 組中，hTERC 基因的擴增在HPV 感染和非感染組之間存在顯著差異（P1=0.000）。同樣的，hTERC 基因表達在SPR-HPV 感染組和非HPV 感染組之間也存在差異（P2=0.021），見表3。

表3 HC2-HPV 及SPR-HPV 組中hTERC 基因的表達情況［n（%）］Tab.3 Expressions of hTERC gene in HC2-HPV and SPR-HPV group ［n（%）］

3 討論

CC 是迄今為止病因較為明確的一種婦科惡性腫瘤，現已明確高風險類型HPV 的持續感染與CC的發生有較強的關聯性，據統計約90%的CC 患者均可發現HPV 感染[7]，因此，HPV 的檢查對于篩檢宮頸癌具有重大意義。本文提到的雜交捕獲II技術（HC2-HPV）是FDA 唯一批準用于臨床檢測HPV 的手段[8]，但其缺點是無法實現HPV 準確的分型，無法指導臨床去甄別高危型HPV 的類別，可造成患者不必要的心理和經濟負擔。而等離子諧振法（SPR-HPV）作為一種可鑒別16 種高危和8 種低危HPV 亞型的檢測方法[9]，彌補了前者在HPV 分型上的短板，可幫助臨床醫生去甄別需要關注與治療的HPV 感染患者，有助于了解各地區HPV 亞型的流行病學特點，對HPV 疫苗的研發與應用具有指導性意義，需要注意的是其特異度和陽性預測值不甚理想。故基于廣泛性篩查和早期明確診斷的出發點來看，急需方便、快捷的生物學指標協同HPV 感染情況來綜合性分析判斷病情，使CC 的早期檢出更精準，可信度更高。

端粒酶系維持人體基因組穩定性的一種核糖核蛋白酶，其在正常組織中表達較少，而在腫瘤組織中表達異常[10]。hTERC 基因作為其主要成分之一，通過增強端粒酶活性以使細胞得到永生，從而成為腫瘤發生的啟動按鈕。包括CC 在內的95%惡性腫瘤細胞中均可用熒光原位雜交法捕獲到hTERC 基因的異常表達。本研究結果表明，hTERC 基因在各宮頸病變分組（從低至高）中的表達率分別為12.5%、34.21%、53.03%、85.71%，宮頸病變與該基因過度擴增有關，且該基因的擴增情況隨著宮頸病變等級的增加而升高，與牛艷昕[11]的結論相一致，分析可能與該基因激活癌基因及促進侵襲分子產生相關。此外，有研究發現HPV 的感染與hTERC 基因的表達之間也存在關聯性[12]，本研究結果顯示隨著病理學分組的升級，hTERC 基因的陽性表達率和HC2-HPV、SPR-HPV的陽性率均呈上升趨勢，該基因與HPV 感染之間呈現正相關性，且HPV 陽性組別中hTERC 基因的表達要顯著高于HPV 陰性組。以上均提示在宮頸病變中hTERC 基因的陽性表達與HPV 的感染密切相關，兩者協同增強端粒酶活性，共同促進了宮頸病變的發生和發展[13]。因此hTERC 基因有望成為宮頸病變發展的預測指標。大量學者[14-15]提出，相比于單獨檢測hTERC 基因的診斷效能，該基因聯合其他標志物（如HPV、C-myc、FOXM1 等）將會對宮頸癌的診斷更有意義。

綜上，宮頸癌是一種發病率較高但發展緩慢的惡性腫瘤，早期的診斷和治療顯得尤其關鍵，除了應用廣泛的HPV 檢測技術，聯合篩檢hTERC基因可顯著提高宮頸病變的檢出率和準確率。隨著對該基因的深入了解和探索，以該基因為靶點的治療理念和藥物在宮頸癌治療前景上表現出極大優勢[16-17]，相信hTERC基因今后將在包括宮頸癌在內的多種惡性腫瘤診療方面發揮更大的應用價值。