競爭ELISA 法檢測人抗脊髓灰質炎病毒（Ⅲ型）中和抗體

張冰潔，趙衛忠，高菁霞，朱文勇，李衛東，廖國陽

（中國醫學科學院北京協和醫學院醫學生物學研究所，云南昆明 650018）

脊髓灰質炎（俗稱小兒麻痹，簡稱脊灰）是由脊髓灰質炎病毒（分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三個型）引起的一種嚴重危害人類（特別是嬰幼兒）健康的急性傳染病，主要通過消化道感染后再形成二次病毒血癥，常累及中樞神經系統，造成永久性殘疾或死亡[1-2]。上世紀50 年代以來，疫苗的廣泛使用為在全世界范圍內消除脊灰提供了有效手段[3-5]。全球范圍內的最后一例Ⅲ型野生脊灰病毒是在2012年在尼日利亞北部檢出。世界衛生組織（WHO）在2015 年正式宣布Ⅲ型脊灰病毒被消滅。為了維持無Ⅲ型脊灰狀態，免疫效果的監測成為了問題。根據全球根除脊灰行動計劃（GAP3）的進程，活病毒包括減毒株在內的所有脊灰活病毒都將要被封存，只能在WHO 認可的少數實驗室中使用，這給脊灰中和抗體評價免疫力帶來了的難題[6]。所以迫切需要一種快速、準確并且易于在基層醫療衛生機構實施的檢測方法，用于疫苗免疫后效果監測和人群免疫屏障的監測。本實驗室早在2007 年建立了多克隆抗體雙抗體夾心ELISA 方法用于檢測血清中和抗體水平[7]，但仍然有進一步研究的價值。本研究建立了競爭ELISA 方法，并從特異性，靈敏性，穩定性和重復性方面進行詳細研究。使用來源于臨床的80 份血清作為研究對象，與中和試驗進行一致性研究，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 細胞

人喉表皮樣癌細胞（HEP-2）購自于美國組織培養庫（ATCC）（CCL-23TM），保存于中國醫學科學院醫學生物學研究所，在本研究中HEP-2 細胞工作代次為：第189 代。

1.2 抗原與抗體

脊髓灰質炎Ⅲ型的Sabin 株病毒滅活液由中國醫學科學院醫學生物學研究所生物四室生產并純化后獲得，批號為2016052310，經質量鑒定實驗室檢測，該批次Sabin Ⅲ型的D 抗原含量為3 187 DU/mL；兔多克隆抗脊髓灰質炎病毒抗體由生物制品五室制備并保存，經純化后檢測其總蛋白濃度為3 mg/mL；待測人血清標本來源于昆明醫科大學第二附屬醫院檢驗科，由該科室負責血清的分離和血清的人口學調查。

羊多克隆抗兔抗體，有辣根過氧化物酶標記（HRP-Goat-anti-Rabbit IgG）購自Abcam 公司，Cat.No.ab6721；牛血清白蛋白（BSA）購自VETEC 公司；TMB 單組份顯色液購自Solarbio 公司，Cat.No.PR1200。

1.3 溶液配制

MEM（50 L 裝）粉劑和M199（50 L 裝）粉劑均購自Gibco 公司，（Lot No.1778268）由中國醫學科學院醫學生物學研究所溶液組配置，滅菌和分裝；新生牛血清購自蘭洲民海生物工程有限公司（Lot No.20180925）。

競爭ELISA 稀釋液：KH2PO40.2 g，Na2HPO4·12 H2O 2.87 g，NaCl 8 g，KCl 0.2 g，加蒸餾水1 000 mL，高壓滅菌室溫保存；再加入BSA 5 g，Tween-20 0.5 mL，充分混勻后備用。競爭ELISA洗液：在上述稀釋液基礎上，不加5 g 的BSA 即為洗板液。

競爭ELISA 反應終止液使用2 mol/L H2SO4，即將濃硫酸11.1 mL 緩慢加入到88.9 mL 去離子水中，充分混勻后備用。

1.4 實驗方法

1.4.1 競爭ELISA 實驗條件探索 采用方陣法[8-9]，首先對最佳包被抗原的使用量和兔多抗脊灰抗體的最佳稀釋度進行探索。該抗原和抗體的稀釋梯度設置見表1。

用稀釋液將Sabin Ⅲ型D 抗原濃縮液按要求進行倍比稀釋后加入酶標板，每孔加100 μL，4 ℃過夜；洗板2 次后加入不同稀釋度的兔抗脊灰抗體100 μL/孔，37℃孵育1.5 h；洗板3 次后加入羊抗兔HRP-IgG （1:6 000），100 μL/ 孔，37℃孵育1 h；洗板4 次加入底物TMB 顯色，100 μL/孔，室溫避光孵育10 min；加入50 μL 終止液，最后測定OD450nm值。

篩選指標：OD450nm值在0.9～1.8 并且與左右相差較大的反應孔抗原濃度與兔抗脊灰抗體稀釋度即為最佳抗原包被量與抗體最佳稀釋度[8-10]。

1.4.2 實驗條件的優化 待測血清最佳稀釋倍數：將待測血清以2 為梯度進行倍比稀釋，從1:4 到1:512 之間，然后與兔多抗脊灰共同孵育，通過抑制率優化待測血清的稀釋倍數。

陽性閾值的確定：使用16 份經過中和試驗確定為陰性的血清，使用競爭ELISA 方法檢測，計算每一份血清的抑制率，然后計算平均抑制率和標準差，陽性血清的閾值為平均抑制率加上三倍的標準差。

最高檢出稀釋倍數的確定：將經過中和試驗確定為陽性的血清，隨機抽取24 份，然后進行2 為梯度，更多倍比稀釋，從1:8 到1:1024 之間。當抑制率接近閾值但大于閾值的稀釋倍數即為待測血清的最高稀釋倍數，也稱為靈敏度。

重復性特征：分別進行了同一塊酶標板中4 復孔的批內差異性分析，不同4 塊酶標板的批間差異性分析，以及兩名經過培訓的工作人員進行的人員差異性分析，經過統計分析，批內、批間和人員變異系數應＜10%，表示重復性較好[7]。

1.4.3 微量中和試驗 使用抗體稀釋法測定待測血清中的中和抗體滴度，首先待測血清從1:4 到1:1024，進行2 為梯度的倍比稀釋，取50 μL，然后與滴度為106.625TCID50/mL 的病毒50 μL 在37℃條件下孵育2 h，然后加入Hep-2 細胞，細胞密度為106個/mL，于35℃培養7 d，通過CPE 的觀察，計算待測抗體的最終中和抗體效價[11-12]。

1.5 統計學處理

本研究數據均采用SPSS 統計軟件和Prism 6.0軟件進行統計學處理，結果以均數±標準差（）表示，顯著性檢驗為Pair Sample T Test 檢驗，計數資料采用卡方檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 競爭ELISA 檢測方法反應條件的優化

將不同濃度的包被抗原（D 抗原）與不同稀釋度的兔抗脊灰（多抗）采用方陣滴定法確定了最佳工作濃度條件，結果見表1。然后在此基礎上，進一步優化得到競爭ELISA 檢測條件為：包被抗原使用濃度：99.6 DU/mL；兔抗脊灰稀釋倍數為1:4000。酶標抗體HRP 標記，羊抗兔（多抗）選擇直線相關性有著良好的范圍內的最佳工作濃度為：0.33 μg/mL。

表1 方陣滴定法確定包被抗原和兔抗脊灰的稀釋倍數的OD450nm 檢測值Tab.1 Square titration method to determine the OD450nm detection value of the dilution multiples of coating antigen and rabbit anti-polio

2.2 待測血清最適稀釋倍數和臨界值的確定

將16 份經過中和試驗證實的陰性血清，按照不同梯度進行稀釋，檢測競爭ELISA 的OD450nm值，結果見圖1，觀察發現待測血清在1:16 稀釋條件下，OD 值進入平臺，曲線斜率降低，該條件為待測血清的最適稀釋倍數。同時計算其平均抑制率為25.03%，SD 為0.013，根據公式計算陽性血清的抑制率臨界值為28.93%，待測血清在1:16 稀釋條件下，抑制率大于該值方能判斷為陽性。

圖1 16 份陰性血清在競爭ELISA 方法中抑制率的散點圖Fig.1 The distribution of scatter plot of inhibition rate of 16 negative serum in competitive ELISA

2.3 競爭ELISA 與中和試驗結果的一致性

對64 份待測血清，同時使用競爭ELISA 方法和中和試驗方法進行檢測，檢測結果見表2，通過χ2檢驗，表面兩種檢測方法在陽性檢出中，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 血清Ⅲ型抗體競爭體ELISA 法與中和試驗檢測方法的比較Tab.2 The results of competition ELISA method and neutralization testing about type serum Ⅲantibody

2.4 競爭ELISA 的特異性

檢測D 抗原和C 抗原上的特異性，將相同濃度99.6 DU/mL 的D 抗原，和56℃，1 h 高溫條件下得到的C 抗原同時按照上述操作進行檢測。當D 抗原轉換為C 抗原后，在使用競爭ELISA，兔抗脊灰不能與之結合，人抗脊灰也不能形成相應的競爭。所以本研究建立的競爭ELISA 具有脊灰病毒D 抗原特異性。

在型上的特異性：使用D 抗原作為包被抗原，在三個型別特異性上進行驗證，分別用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型抗原，按照相同的D 抗原濃度進行包被，結果發現，Ⅲ型抗體與其它兩個型的抗原不發生交叉反應。所以本研究建立的競爭ELISA 具有脊灰病毒Ⅲ型特異性。

2.5 靈敏特性

將待測血清按照1:2 的梯度進行倍比稀釋，然后使用競爭ELISA 方法進行檢測，結果觀察到，當待測血清稀釋度為1:256 時，抑制率能保持31.22%，但是進一步待測血清稀釋度為1:512 時，抑制率為26.73%。所以競爭ELISA 檢測檢測的待測血清的最高稀釋倍數為256 倍，最適稀釋倍數為16 倍。

2.6 重復性驗證

在相同的酶標板中，平行選擇四孔復孔進行批內重復試驗檢測，其變異系數在3.296 %～4.518%；選擇六塊酶標板進行批間重復性試驗，其變異系數在5.26%～6.11%；對兩名專業技術人員進行培訓后使用相同檢測試劑進行重復性試驗，其變異系數為7.21%～8.245%。結果表明該檢測方法具有良好的重復性。

3 討論

目前全球正處于消滅脊灰的最后階段，Ⅱ和Ⅲ型脊灰病毒已宣布被消滅，目前僅脊灰病毒Ⅰ型野毒株在阿富汗，尼日利亞和巴基斯坦等國家和地區流行，但由于疫苗衍生毒株的產生，以及生活環境污水中脊灰能存活3～5 a 等因素下，在全球范圍內消除脊灰仍然任重而道遠[13-15]。解決的有效手段是加強人群的免疫，特別是新生嬰幼兒，及時建立并鞏固人群免疫屏障，并完善相應的疫苗免疫效果監測與管理[14-15]。另一個方面，封存脊灰野毒株以及Sabin 株的大前提下，建立開發新的可靠的檢測方法成為了一項重要工作，因為一旦封存，過去建立在中和試驗基礎上的免疫效果監測就將難以開展，所以本研究具有很好的現實意義。

本研究成功建立了競爭ELISA 方法檢測人抗脊灰中和抗體的方法，不使用活的脊灰病毒，符合國家規程的要求。而且與2007 年的雙抗體夾心ELISA 方法[7]檢測的不同，在一定程度上于提高了樣品檢測的陽性率，避免了假陰性的檢驗誤差，能夠更加真實地反映人群中的抗體水平。競爭ELISA方法通過抑制率作為陽性判斷的標準，具有良好的科學性，能夠有效判斷待測血清的結果，而不簡單依賴于OD 值的判斷，有效減少了誤差。

WHO 在上世紀就提出了消滅脊灰行動，我國目前也保持無脊灰狀態多年，但是由于脊灰疫苗相關病例與VDPV 循環，以及全球交通互通互聯加快，人口流動的范圍、速度、頻次增加，病毒輸入和傳播的機率加大，所以對脊灰抗體水平的監測是一項長期的工作[16-17]，本研究為該工作的開展提供了一種行之有效的方法，值得在廣大基層醫療衛生機構中推廣。