開設減數分裂同源染色體聯會與重組觀察實驗

王宏剛，魏 遠，陳成彬，王春國，宋文芹，白艷玲，黃桂安,2

（1.南開大學 生物國家級實驗教學示范中心，天津 300071；2.青島農業大學 生命科學學院，山東 青島 266109）

減數分裂是一種發生在真核生物有性生殖細胞形成過中的一種特殊的有絲分裂形式，是生物遺傳和變異的細胞學基礎[1-2]。同源染色體聯會與重組是發生在減數分裂前期I 的重要生理活動。近年來，對同源染色體聯會與重組的研究已經成為減數分裂領域的研究熱點之一[3-4]。隨著教學改革的深入，各個高校越來越重視科研前沿技術在實驗教學中的應用[5-6]。通過在實驗課程中開設減數分裂同源染色體聯會與重組觀察實驗，可以幫助學生對同源染色體聯會與重組過程中聯會復合體和重組節形成直觀的認識，讓他們更加了解同源染色體聯會與重組的過程。教學過程中，首先制作小鼠精母細胞的染色體展片，然后通過免疫熒光雙標技術對聯會復合體蛋白SCP1 和SCP3 的熒光標記，最后在熒光顯微鏡下觀察減數分裂前期I 各時期聯會復合體的特點。另外，使用MLH1（MutL homologue 1）的單克隆抗體對聯會復合體上的重組節進行標記，可以對減數分裂中的同源重組現象進行觀察。

1 實驗儀器與器材

1.1 實驗儀器

正置熒光顯微鏡、離心機。

1.2 實驗器材

染色缸、濕盒、封口膜、1.5 mL 離心管、剪刀、鑷子、一次性培養皿、移液器。

2 實驗材料與試劑

2.1 實驗材料

成年雄性小鼠。

2.2 實驗試劑

抗小鼠SCP3 抗體（山羊來源）、抗小鼠SCP1 抗體（兔來源）、抗小鼠MLH1 抗體（兔來源）、FITC標記的抗山羊抗體、Rhodamine 標記的抗兔抗體、FITC標記的抗兔抗體、Rhodamine 標記的抗山羊抗體、PBS-T（在PBS 中加入終濃度為0.1%的Trion X 100）、5% BSA（稱取0.5 g BSA 溶于10 mL PBS-T 中）、PBS、100mmol/L 蔗糖溶液、1% PFA、0.4% Photoflo、封片劑、DAPI、70%乙醇。

3 實驗方法

3.1 減數分裂染色體展片的制備

斷頸法處死小鼠，用70%乙醇對小鼠進行消毒處理。取出小鼠的睪丸放入盛有PBS 的一次性培養皿中。用鑷子將睪丸表面的白膜除去，拉出長段的曲細精管。取長約5 cm的曲細精管，放入盛有200 μL PBS的1.5 mL離心管中，用剪刀將曲細精管剪碎。補加PBS 至1 mL，然后用移液器吹打多次，使細胞盡量從曲細精管中游離出來。室溫靜置1 min，取上清。200 g 離心3 min，PBS 漂洗細胞2 次。細胞沉淀用100～200 μL 的100mmol/L蔗糖溶液重懸，制成細胞懸液。用1% PFA 溶液浸潤載玻片，取40 μL 細胞懸液滴到載玻片中央，濕盒中放置3 h。取出載玻片充分晾干，用0.4% Photoflo 清洗2 min，晾干后放入載玻片盒，-20 ℃保存備用。

3.2 小鼠SCP3 蛋白和SCP1 蛋白的免疫熒光標記

取出制備好的減數分裂染色體展片標本，使用PBS-T 洗10 min。滴加50 μL 5% BSA 至一塊比載玻片稍小封口膜上，將染色體展片標本倒扣到封口膜上，放入濕盒處理0.5～1 h。去掉封口膜，去除封閉液。將1∶100 稀釋的抗小鼠SCP3 抗體（山羊來源）和抗小鼠SCP1 抗體（兔來源）等體積混合，取20 μL 抗體混合液滴到封口膜上，將載玻片反扣到封口膜上，濕盒中室溫孵育1 h。孵育完成后，用PBS-T 漂洗載玻片3 次，每次10 min。將1∶100 稀釋的FITC-抗山羊二抗和Rhodamine-抗兔二抗等體積混合，取20 μL 熒光二抗混合液滴加到新的封口膜上，載玻片反扣到封口膜上，濕盒中室溫避光孵育0.5～1 h。孵育完成后，用PBS-T 漂洗載玻片3 次，每次10 min。晾干后，取15 μL 封片劑至載玻片上，蓋上蓋玻片，用指甲油封住邊緣。正置熒光顯微鏡下，使用綠色熒光模塊對SCP3 進行觀察和拍照，使用紅色熒光模塊SCP1 進行觀察和拍照。

3.3 小鼠SCP3 蛋白和MLH1 的免疫熒光標記

實驗方法同節3.2，一抗使用抗小鼠SCP3 抗體（山羊來源）和抗小鼠MLH1 抗體（兔來源），二抗使用Rhodamine 標記的抗山羊抗體和FITC 標記的抗兔抗體。使用綠色熒光模塊對MLH1 進行觀察和拍照，使用紅色熒光模塊對SCP3 進行觀察和拍照。

4 實驗結果

4.1 小鼠SCP3 蛋白和SCP1 蛋白的免疫熒光標記

根據減數分裂前期I 各階段染色體聯會特點，在熒光顯微鏡下尋找細線期、偶線期、粗線期、雙線期和終變期的細胞，如圖1 所示。

4.2 小鼠SCP3 蛋白和MLH1 的免疫熒光標記

染色體的同源重組現象發生在粗線期，在顯微鏡下尋找粗線期的細胞進行觀察，如圖2 所示。

5 討論

5.1 同源染色體聯會與DNA 同源重組的重要性

圖1 減數分裂前期I 各階段聯會復合體的形態（100×）

圖2 減數分裂前期I 粗線期聯會復合體和重組節的形態（100×）

同源染色體聯會與重組是發生在減數分裂前期I的重要生理活動，也是遺傳學教學中的重要知識點。聯會復合體能夠為聯會的發生和同源染色體交叉提供框架，是同源染色體聯會和基因重組的關鍵性結構[7]。聯會復合體的異常將導致聯會不能正常進行，不能產生正常的配子。圍繞聯會復合體形態進行的研究已經廣泛應用于精子發育異常、雄性不育癥機理研究和臨床診斷領域[8-9]。這些知識與生命科學類及相關專業本科生未來的學習和科研緊密相關。目前，在大部分高校中，該知識點的教學僅在理論課層面展開，并沒有實驗課程與之匹配。在實驗課程中開設相關的實驗項目，讓學生直觀地觀察到聯會復合體和重組節形態特點，可以幫助他們了解和掌握同源染色體聯會和DNA同源重組。

5.2 實驗的注意事項

染色體展片是本實驗的一個難點，為了獲得較多的精母細胞，操作時就要盡量將曲細精管剪碎。此外，展片需要一定的時間，時間越長細胞的分散度越好，同時要注意保濕，防止細胞懸液蒸發。實驗采用了免疫熒光雙標的方法，2 種抗體混合的比例需要通過預實驗來確定，避免出現2 種熒光亮度差距較大的問題。

5.3 教學的組織安排

減數分裂同源染色體聯會與重組觀察實驗主要包括3 部分內容：“減數分裂染色體展片的制備”需要5～6 學時，“SCP3 和SCP1 的免疫熒光標記”需要4～5學時，“SCP3 蛋白和MLH1 的免疫熒光標記”需要4～5學時。在組織教學時，這3 部分可以作為3 個獨立的實驗項目開設，也可以將“減數分裂染色體展片的制備”同“SCP3 和SCP1 免疫熒光標記”或“SCP3 和MLH1 免疫熒光標記”進行組合，作為一個8～10 學時的實驗項目，還可以將3 部分內容組成一個14～16 學時的綜合性實驗。

6 結語

在理工類專業創新性科研人才培養的過程中，實驗教學發揮著非常重要的作用。通過實驗教學的改革來助力創新性科研人才的培養也越來越受到大家的認可[10-12]。將與科研前沿緊密相關的知識轉化為實驗項目，使這些實驗教學的教學內容更加貼近科研實踐，提高學生對科學研究的興趣，為創新性人才培養模式探索提供思路。