環氧化物水解酶交聯細胞聚集體催化合成（R）-環氧氯丙烷

鄒樹平，姜鎮濤，王志才，柳志強，鄭裕國

（浙江工業大學生物工程學院手性生物制造國家地方聯合工程研究中心，浙江杭州310014）

引 言

手性環氧氯丙烷是重要的C3合成子，其中(S)?環氧氯丙烷（(S)?ECH）是降血脂藥物阿托伐他汀、降血壓藥物卡維地洛等醫藥的前體[1]；(R)?環氧氯丙烷（(R)?ECH）是治療心絞痛藥物美托洛爾和減肥藥物肉毒堿合成的關鍵中間體[2?3]。近年來，環氧氯丙烷生產工藝趨于成熟，規模逐年擴大，成本和價格持續走低[4]，因此，利用消旋體環氧氯丙烷制備手性環氧氯丙烷具備巨大的經濟效益與可行性[5?7]。環氧化物水解酶（epoxide hydrolase, EC 3.3.2.3），廣泛存在于自然界中，該酶可以將消旋體環氧化物立體選擇性水解生成手性環氧化物及相應的鄰二醇[8]。由于反應條件溫和、立體選擇率高、環境友好等優勢，酶法催化合成手性環氧氯丙烷受到廣泛關注[9?11]（圖1）。

生物催化劑在實際應用時，往往存在操作穩定性差、難以重復使用、使用成本高等問題，而這些問題通常可通過細胞或酶的固定化得到解決[12?13]。目前，大部分關于環氧化物水解酶固定化主要通過海藻酸鈣[14]、環氧樹脂[15]、DEAE?cellulose[16]、磁性納米顆粒[17]等進行固定化，這些方法實現了環氧化物水解酶熱穩定性和操作穩定性一定程度的提高，但仍存在一些缺點，如固定化顆粒機械強度低、傳質阻力高、非催化功能的載體占比大等。交聯細胞聚集體（CLCAs）是利用絮凝?交聯技術將全細胞固定化的一種新方法，具有操作簡單、成本低、細胞活力回收率高、比活性高、操作穩定性好等優點[18?19]，具有巨大的工業應用潛力。

本實驗室在前期將放射形農桿菌環氧化物水解酶基因在大腸桿菌BL21（DE3）中高效表達[20]，對環氧化物水解酶進行迭代飽和突變，獲得了立體選擇性和催化效率大幅度提高的環氧化物水解酶突變體I108L/D131S/T247K[21]，并通過建立兩相催化體系克服了底物的自發水解。本研究以重組表達環氧化物水解酶突變體的重組大腸桿菌BL21（DE3）為全細胞催化劑，建立了環氧化物水解酶交聯細胞聚集體的制備方法，并利用環氧化物水解酶交聯細胞聚集體催化合成(R)?ECH，旨在為手性環氧氯丙烷的生物制造新技術開發提供指導。

1 實驗材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和試劑 本實驗所用菌株為實驗室已構建的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28b?EH I108L/D131S/T247K[21]。50%聚乙烯亞胺（PEI）購自上海晶純生化科技股份有限公司。海藻酸鈉、聚乙烯醇（分子量10000）、卡拉膠、25%戊二醛（GA）、硅藻土等試劑與原材料均為市售。異辛烷為市售分析純。卡那霉素和異丙基硫代?β?D?半乳糖苷（IPTG）購于Sigma公司，酵母粉、蛋白胨購自OXOID公司，(R,S)?ECH（分析純）、(S)?ECH（98%）、(R)?ECH（98%）、3?氯?1,2?丙二醇（97%）均購于阿拉丁公司。除特別注明的試劑外，其他實驗試劑均為國產分析純。

圖1 環氧化物水解酶交聯細胞聚集體的制備過程及催化合成(R)?ECHFig.1 Preparation process of cross?linked cell aggregates of epoxide hydrolase and its application for the synthesis of (R)?epichlorohydrin

1.1.2 培養基 LB 培養基（g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，LB 固體培養基中含1.8%瓊脂。高壓滅菌條件為121℃，20 min。

1.2 方法

1.2.1 環氧化物水解酶全細胞的制備 將活化后的環氧化物水解酶工程菌按2%（體積）的接種量接入裝有100 ml LB 培養基的500 ml 錐形瓶中，置于37℃、200 r/min 搖床振蕩培養，當培養液的OD600達到0.6～0.8時，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG作為誘導劑，28℃誘導10 h，離心收集菌體，?20℃保存。

1.2.2 交聯細胞聚集體（CLCAs）的制備 10 g 濕細胞加入100 ml 磷酸鹽緩沖液中（pH=7.0, 100 mmol/L）配成菌懸液，將500 g/L PEI 按質量比稀釋10 倍，加入6 g/L 硅藻土攪拌30 min，再加入1%(體積)PEI進行絮凝，攪拌30 min 后靜置10 min，然后加入1%(體積) GA 進行交聯反應，攪拌30 min，最后通過真空抽濾回收，用0.9%生理鹽水洗滌三次，抽濾后濾餅保存于4℃冰箱中備用。

1.2.3 活力的測定 環氧化物水解酶全細胞活力測定采用氣相色譜進行測定，10 ml反應體系中加入100 mmol/L(R,S)?ECH，適量的游離細胞或固定化細胞以及磷酸鹽緩沖液（200 mmol/L，pH 8.0），35℃下180 r/min 振蕩器反應5 min，后取樣200 μl 于800 μl乙酸乙酯中萃取，取有機相無水硫酸鈉干燥后，進行氣相檢測。活力單位（U）定義：在35℃、pH 8.0 條件下，在1 min 內催化1 μmol ECH 水解所需要的酶量定義為1 U；比活力（U/g）定義為每克干重的細胞具有的總活力單位。固定化細胞的活力回收率計算公式如下：

1.2.4 交聯細胞聚集體催化合成（R）?ECH 一定比例異辛烷/磷酸鹽緩沖液（pH8.0）兩相體系40 ml，加入干重0.72g CLCAs混勻，35℃保溫10 min后加入一定濃度(R,S)?ECH，攪拌反應40 min，期間取樣200 μl 加入800 μl 乙酸乙酯萃取，取有機相用無水硫酸鈉干燥后進行氣相檢測。

1.2.5 分析方法 手性ECH 分析方法：采用日本島津氣相色譜儀GC?14A 系統，色譜柱類型：BGB?175毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。色譜條件：柱溫90℃，進樣室溫度220℃，FID 檢測器220℃，保留7 min，載氣為He，流量為1.6 ml/min，分流比1∶40，保留時間：(S)?ECH 5.1 min，(R)?ECH 5.3 min。

2 實驗結果與討論

2.1 細胞固定化方法的篩選

為了篩選環氧化物水解酶全細胞最適合的固定化方法，研究了4種不同的細胞固定化方法，涉及包埋法和絮凝?交聯法。測定了細胞活力回收率，以及循環5 次后全細胞的殘余活力。結果如表1所示。

表1 固定化方法的篩選Table 1 Screening of immobilization method

表1結果顯示，利用絮凝?交聯法制備的CLCAs活力回收率高達82.7%，且固定的細胞結合致密，不易脫落，循環5次后活力幾乎不損失，這和其他交聯法 固 定 化 細 胞 Bacillus subtilis ZJB?063 和Arthrobacter nitroguajacolicus ZJUTB06?99 研究結果相符[22?23]。然而，采用海藻酸鈣、聚乙烯醇?海藻酸鈣以及卡拉膠包埋的全細胞活力回收率普遍較低，甚至未表現出明顯活力，說明包埋法可能不適合該環氧化物水解酶全細胞的固定化，本實驗室前期研究也證明海藻酸鈣包埋的效果一般[24]。

2.2 交聯細胞聚集體制備條件優化

圖2 交聯法固定化過程中PEI（a）、GA（b）、硅藻土（c）用量的優化Fig.2 Optimization of PEI(a)，GA(b)and diatomite(c)concentration in the process of cross?linking immobilization

制備交聯細胞聚集體時，對催化能力影響較大的因素一般為絮凝劑、交聯劑和載體的用量[22?23]，因此，對交聯細胞聚集體制備過程中的PEI、GA 和硅藻土用量進行優化。如圖2 所示，考察了交聯細胞聚集體活力回收率和操作穩定性。隨著PEI 和GA濃度增加，細胞活力回收率降低，操作穩定性提高[圖2(a)、(b)]，由于細胞經過PEI 和GA 的交聯后，固定化顆粒表面包裹一層紅色的聚合物膜，且該膜致密度以及機械強度隨PEI、GA 濃度增加而增大，與此同時會造成傳質阻力增大[25?26]。綜合考慮，選擇3%（體積）PEI，1%（體積）GA 為最佳濃度。硅藻土不僅具有吸附和抗溶脹效果，還具有塑形、助濾和改善固定化顆粒傳質特性的作用，并且價格相對較低[27]。當以硅藻土為載體時，隨著硅藻土質量分數的增加固定化細胞活力回收率增加，而機械強度下降[圖2(c)]，綜合考慮，選擇6 g/L 的硅藻土為最適添加量。在PEI濃度、GA 濃度及硅藻土載體用量分別為3% (體積)和1%(體積)和6 g/L 條件下，交聯細胞聚集體活力回收率可達88.4%。

2.3 兩相中環氧化物水解酶交聯細胞聚集體催化合成（R）-ECH

由于環氧化物對生物催化劑有毒害作用，且化學性質活潑，在單一水相中易發生自發水解反應，導致反應效率不高，而應用有機溶劑/緩沖液兩相體系能夠克服這一缺點[28?30]。根據實驗室前期關于有機溶劑對環氧化物水解酶催化反應的影響研究結果[31]，確定了異辛烷/磷酸鹽緩沖液為最佳的兩相體系。本文中進一步研究了兩相體系的異辛烷比例和底物負載量。如圖3(a)所示，隨著反應體系中異辛烷含量的增加，活力逐步提高并在異辛烷含量為30%時達到最高，后迅速降低。這主要是由于：一方面，異辛烷的添加導致大部分底物分配于有機相中，在水相中保持較低的濃度，減少了底物對水相中菌體的毒害作用。另一方面，高濃度異辛烷會對細胞產生毒性，導致活力降低甚至失活[31]。因此，確定兩相體系中異辛烷/磷酸鹽緩沖液的最佳比例為3∶7。由于非天然的有機底物(R,S)?ECH 對細胞有一定毒害性[32]，有必要考察底物濃度對生物催化反應的影響。如圖3(b)所示，當底物濃度小于800 mmol/L 時，(R,S)?ECH 轉化完全，(R)?ECH 的ee 值都能達到99%以上，而進一步提高底物濃度，(S)?ECH不能被完全水解，(R)?ECH 的ee值迅速降低，這可能是因為高有機底物濃度對細胞有毒害作用，從而對ECH的水解存在抑制作用[31]。

圖3 兩相體系中反應參數對(R)?ECH合成的影響(a)異辛烷比例對細胞活力的影響;(b)底物濃度對(R)?ECH ee值的影響Fig.3 Effect of reaction parameters on(R)?ECH synthesis in biphase system(a)effect of isooctane ratio on cell activity;(b)effect of substrate concentrations on ee of(R)?ECH

為了進一步提高催化效率、保證產物光學純度，在反應進程中補加全細胞催化劑已被證明是可行的策略[33]。因此嘗試通過補加CLCAs的方式提高底物負載和催化效率。如圖4 所示，在800 mmol/L底物濃度下催化反應進程曲線顯示(S)?ECH 在2 min 左右被反應完全，此時(R)?ECH 剩余361 mmol/L，收率為45.2%[圖4(a)]。進一步提高底物濃度至1 mol/L，(R)?ECH ee 值為70%左右[圖4(b)]；間歇補加干重0.5g 的CLCAs 后，反應進行到15 min 時(R)?ECH ee 值可達100%，收率為32%左右[圖4(c)]。連續流加干重0.5g 的CLCAs 后，反應進行到30 min 時(R)?ECH ee 值可達100%，收率約為31%[圖4(d)]。可以看出，底物濃度提高至1mol/L 后通過補加催化劑可使(R)?ECH ee 值達到100%，但收率明顯下降。補加的CLCAs 活力僅為初始CLCAs 的35%。進一步分析發現，細胞補加前副產物3?氯?1,2?丙二醇（3?MCP）濃度積累到520 mmol/L（其中(S)?3?MCP約410 mmol/L；(R)?3?MCP 約110 mmol/L）。可能存在的產物抑制導致菌體活力下降，較高濃度(S)?3?MCP 抑制殘余的(S)?ECH 水解，而(R)?ECH 所受抑制并不明顯，進而縮小了兩種構型底物反應速率，最終導致(R)?ECH收率下降。

為了驗證是否存在產物抑制，研究了不同3?MCP 濃度對活力的影響和3?MCP 存在時對反應進程的影響。如圖5(a)所示，相比于對照組，添加3?MCP的菌體活力顯著降低，且隨著3?MCP 濃度增加至300 mmol/L，活力大幅下降。圖5(b)展示了副產物存在時對催化反應進程的影響。以1 mol/L(R,S)?ECH 反應后的上清液（包含395 mmol/L (R)?ECH，90 mmol/L(S)?ECH 和515 mmol/L 3?MCP）[反應（1）]和人工配制的395 mmol/L (R)?ECH，90 mmol/L (S)?ECH 混合液[反應（2）]為底物，進行反應，可以發現反應（2）中(S)?ECH 被迅速消耗殆盡，(R)?ECH ee 值在1 min 內即達到100%，而在含有產物3?MCP 的反應（1）中，初始反應速率不到反應（2）的1/3，(R)?ECH ee 值在12.5 min 時才達到99%，從而證實催化反應存在不可忽視的產物抑制問題。

綜上所述，在兩相中環氧化物水解酶交聯細胞聚集體催化合成(R)?ECH 的體系中，在異辛烷與緩沖液的體積比3∶7，底物濃度800 mmol/L，CLCAs 加入量18 g/L，緩沖液pH 8.0，溫度35℃條件下，(R)?環氧氯丙烷的摩爾產率可達到45.2%，產物光學純度為99.1%ee。與已報道的生物法合成(R)?ECH 研究[10,24,29,34?35]相比，本研究建立的800 mmol/L 底物濃度和45.2%的(R)?ECH收率均已處于較高水平。

2.4 CLCAs的操作穩定性

在異辛烷/磷酸鹽緩沖液兩相體系中，(R,S)?ECH濃度800mmol/L，添加干重18 g/L CLCAs進行反應，反應結束后對CLCAs進行抽濾回收，添加新鮮底物與有機溶劑進行下一批反應，如圖6所示，CLCAs在9個循環使用后活力幾乎不損失，且(R)?ECH的ee值均能達到99%。由于反應過程中機械攪拌且高底物濃度底物易導致游離細胞破損，在8000 r/min條件下離心10 min回收細胞時泄漏的環氧化物水解酶導致活力損失，因此游離細胞循環使用4次后，活力僅為初始的30%。因此，CLCAs顯著提高了細胞的機械強度，顯示了良好的操作穩定性[12]。

圖4 兩相體系中交聯細胞聚集體催化合成(R)?ECH反應進程曲線(a)800 mmol/L底物濃度;(b)1 mol/L底物濃度;(c)1mol/L底物濃度下間歇補加CLCAs;(d)1 mol/L底物濃度下連續流加CLCAs;綠色箭頭為開始補加,紫色箭頭為結束補加Fig.4 Reaction process of the synthesis of(R)?ECH catalyzed by CLCAs in biphase system(a)substrate concentration at 800 mmol/L;(b)substrate concentration at 1 mol/L;(c)substrate concentration at 1 mol/L with intermittent CLCAs addition;(d)substrate concentration at 1 mol/L with continuous CLCAs addition;the green arrow is the start of CLCAs addition and the purple arrow is the end of CLCAs addition

圖5 副產物3?氯?1,2?丙二醇對催化反應的影響(a)3?氯?1,2?丙二醇濃度對酶活力的影響;(b)副產物3?氯?1,2?丙二醇存在時對(R)?ECH合成反應進展的影響Fig.5 Effect of 3?chloro?1,2?propanediol on the catalytic reaction(a)effect of 3?chloro?1,2?propanediol concentration on enzyme activity;(b)effect of 3?chloro?1,2?propanediol on the reaction process of the synthesis of(R)?ECH

圖6 交聯細胞聚集體與游離細胞的反應批次Fig.6 Recycling batch of CLCAs and free cells

3 結 論

本文以重組環氧化物水解酶大腸桿菌工程菌為研究對象，建立了交聯細胞聚集體的制備方法，最佳制備條件為PEI 3%（體積）、GA 1%（體積）、硅藻土6 g/L，該條件下細胞表面的交聯網絡密度合適，兼顧了機械強度和傳質速率，活力回收率可達到88.4%。同時開發了異辛烷/磷酸緩沖液兩相體系，異辛烷對底物溶解能力強，兩相體系緩解了底物ECH 在水相的自發水解，減輕了細胞在水相中受到的底物抑制和毒害，最大底物負載達到800 mmol/L。利用CLCAs 進行催化合成(R)?ECH 反應，(R)?ECH 濃度達到361 mmol/L，產物收率為45.2%，ee 值均＞99%，交聯細胞聚集體表面聚合物網絡有效提高了細胞操作穩定性，重復使用9批次后，活力基本不變。CLCAs 具有優越的催化性能，操作穩定性好，具有良好的工業化應用前景。