合成生物系統構建與綠色生物“智”造

秦磊，俞杰，寧小鈺，孫文濤，李春，2

（1 北京理工大學化學與化工學院化學工程系生物化工研究所，北京100081； 2 清華大學化學工程系生物化工研究所/工業生物催化教育部重點實驗室，北京100084）

引 言

化石資源短缺和環境破壞問題的日益加劇促使人們尋求一種綠色可持續的生物制造方式來生產燃料、藥品、大宗化學品和精細化學品。微生物細胞工廠的出現為高效且可持續的生產提供了新方法。在代謝工程、合成生物學和系統生物學的協同發展下，通過微生物細胞工廠生產生物燃料、藥品、精細化學品等均取得了重大進展[1?5]，利用大腸桿 菌（Escherichia coli）[6?7]、谷 氨 酸 棒 桿 菌（Corynebacterium glutamicum）[8?9]及 酵 母（yeast）[10?14]等常用的微生物細胞工廠已實現了多種產品的生產。

目前，微生物細胞工廠的構建與優化仍存在著許多挑戰。一方面，微生物目標合成途徑的強化會受到細胞本身復雜的代謝調控網絡的限制。無論是內源途徑還是異源途徑，常會遇到目標途徑通量低、代謝通量不平衡、競爭途徑抑制及有毒中間產物積累等問題，從而使細胞生長及生產受到抑制[15]。因此，對代謝途徑進行動態調控使目標產物的產量最大化，是優化微生物細胞工廠的一致方向。另一方面，工業發酵環境存在各種脅迫因素，如高溫、氧化、pH波動、高滲透壓、有機溶劑、重金屬等因素，都會對微生物的生長和生產造成影響[16?22]。工廠對發酵條件的嚴格控制雖然可以提高菌株生產的穩定性，但同時會增加大量成本，包括使用冷卻水、酸堿、過濾裝置等，并且增加了對環境的破壞。因此，提升工業菌株的魯棒性是提高產量和降低成本的根本解決方案。

提高生物制造過程的智能性是解決上述問題的重要途徑。生物“智”造，即智能化的生物制造，是指微生物根據發酵的環境變化或發酵的不同階段進行基因、轉錄、翻譯或蛋白質水平的調節，從而實現更好的生長或生產。生物制造的智能化可以使微生物動態地調整自身，使其向更有利的方向發展。例如，在發酵生產一些毒性產物的過程中，要使菌株在發酵前期積累生物量，從而盡量減少產物對細胞的毒害，在中后期再開始合成產物并提高產量。又如，面對工業發酵罐中溫度和pH 等的局部波動，要使菌株在脅迫環境下抵抗干擾，而在無脅迫時減少抗逆系統的能量消耗。

圖1 生物“智”造包括的主要內容Fig.1 The brief contents of intelligent biological manufacturing

本文將從蛋白質設計的智能化、生物傳感的智能化、代謝調控的智能化、菌株進化的智能化及發酵過程的智能化五個方面來分別介紹（圖1）。隨著合成生物學和代謝工程的發展，生物“智”造的智能化程度也將逐步加深，為提高發酵產量和節能減排做出重要貢獻。

1 蛋白質設計的智能化

通過定向進化獲得目標功能的蛋白質有較強的隨機性，而依靠計算機算法的蛋白質設計則體現出智能性。利用大分子建模軟件Rosetta 等可以實現蛋白結構預測、分子對接、結構設計和實驗數據建模等任務[23]，并且隨著軟件功能的開發、計算機運算能力的提高以及設計方法的完善[24]，模型預測的準確度也將進一步提高。受限于人們目前的知識水平，完全從頭設計出目標催化功能的酶還無法實現，但從頭設計出具有某些調節功能的調節蛋白已取得了一些重要突破。

1.1 蛋白質變構調節的智能化

蛋白質的變構調節功能在生物中廣泛存在，在生物過程調控中起到非常重要的作用。Baker 等[25]以α?螺旋為結構單元設計出了一系列蛋白質調節元件。α?螺旋的模塊化程度較高，因此便于從頭設計和預測。通過Rosetta 設計的97對α?螺旋異源二聚體中，有65 對經實驗驗證形成了預期的二聚體[25]，這表明盡管目前的計算機智能設計能夠預測正確大部分結果，但方法和技術仍有待完善。

研究者基于α?螺旋的異源二聚體或同源三聚體結構，設計出了pH 調控的二/三聚體解聚過程：在α?螺旋中插入組氨酸殘基，使組氨酸殘基在酸性條件下質子化，增強了靜電和空間排斥作用，從而使多聚體解聚[圖2(a)]；由于α?螺旋單體能夠破壞磷脂膜，因此用該元件可實現pH 誘導的磷脂膜降解[26]。另外，對α?螺旋的長度和親/疏水性進行設計，可實現酸性條件誘導α?螺旋在膜上聚合形成通道蛋白[27]。在自然界中也會發現一些pH 誘導的蛋白質變構。例如，李斯特菌溶血素O 是一種穿孔毒素，它的突變體Y406A 具有很強的pH 依賴性，只有在低pH 下才能形成通道[28]。通道的形成還受一些特異性蛋白的抑制，可受pH 和抑制蛋白的雙重調節[29]。

在α?螺旋同源三聚體的基礎上，研究者設計了一套蛋白質開關：通過加入“鑰匙”釋放“籠子”中的“門閂”[圖2(b)]。將“門閂”替換為降解決定子（能夠被泛素蛋白識別從而被降解），實現了目標蛋白的誘導降解，用此降解開關實現了轉錄因子、Cas 蛋白以及信號傳遞途徑的調控[30?31]。

圖2 蛋白質變構調節的從頭設計(a)pH誘導的α?螺旋同源三聚體的解離[26];(b)基于α?螺旋的蛋白質開關[30]Fig.2 De novo design of tunable conformational changes of proteins(a)pH?induced dissociation of α?helix homotrimer[26];(b)α?helix based protein switch[30]

利用不同α?螺旋異源二聚體之間的正交性[25]，研究者設計出了各種蛋白質的邏輯門[32]，這些邏輯門的功能幾乎不受宿主種類的影響，極大地豐富了合成生物學的可用元件。

1.2 酶催化的智能化

相較于α?螺旋的設計，酶的催化活性口袋的從頭設計則困難得多，因為設計對于小分子配體具有高度親和性和高度選擇性的蛋白質仍無法十分精準。研究者根據配體結合蛋白的基本設計原則，得到了能夠結合地高辛、孕酮和β ?雌二醇的蛋白質[33]。

對天然的酶的智能化改造是目前更可行的方法。一些酶的雜泛性（promiscuity）使其催化的底物或產物不專一，使人們可以對其結構進行微調，實現利用不同的底物生產不同的產物。例如，植物P450 酶在微生物中表達時通常表現出雜泛的區域選擇性和化學選擇性，可同時氧化不同的底物合成多種結構類似物[34]。基于同源建模與分子對接分析的理性設計，利用一個雜泛性的P450酶構建了一系列具有特定功能的突變體，可識別具有不同性質的底物并具有可控的氧化過程，實現稀有甘草三萜的特異性合成。此外，對影響P450酶氧化選擇性的關鍵因素進行了研究，實現了特定底物的自動選擇和特定產物的選擇性合成，從而為進一步實現酶活性口袋的智能設計提供了基礎[圖3（a）][35]。

另外，許多酶在細胞中都顯現出多種催化活性，并且催化活性受一些環境因素的影響。例如，DesK 是枯草芽孢桿菌的一個膜蛋白，在低溫（25°C）時，其細胞質催化結構域表現出蛋白激酶活性，將轉錄因子DesR 磷酸化；在高溫（37°C）時，催化結構域表現出磷酸酶活性，將DesR 去磷酸化[圖3（b）]。這是由于低溫時細胞膜流動性差，高溫時細胞膜流動性強，細胞膜的流動性使其厚度發生一些改變，影響蛋白的跨膜結構域及連接肽的構象變化，最終影響催化結構域的構象改變[36]。

2 生物傳感的智能化

生物傳感是菌株智能化的基礎。合成生物學中的生物傳感器（biosensor）是指能夠感應某種物理、化學或生物信號的生物學元件。生物傳感器具有兩種功能，一是“傳”，即傳遞信號，起到調節控制的作用，如轉錄調節元件和翻譯調節元件；二是“感”，即感應信號，可以理解為信號的轉換輸出，如具有感應功能的熒光蛋白等。

2.1 轉錄調節元件作為生物傳感器

啟動子是調節基因表達的最主要最直接的調控元件，其與轉錄因子的相互作用可實現多種生物傳感器的功能，實現對基因轉錄的開關或強度調節。下面介紹響應幾種重要因素的轉錄調節元件類生物傳感器。

圖3 酶催化的智能化(a)利用酶的雜泛性合成不同產物[35];(b)通過調節溫度改變酶的性質[36]Fig.3 Intelligence of enzymes(a)synthesis of various products by enzyme promiscuity[35];(b)changing properties of enzymes by regulating temperature[36]

2.1.1 糖或糖苷類 微生物中的碳源誘導機制常被用于基因表達的開關，例如，原核細胞中經典的異 丙 基 硫 代 半 乳 糖 苷（isopropyl β ?D?thiogalactoside，IPTG）誘導[37]、阿拉伯糖誘導[38]、木糖誘導[39]等，酵母中經典的半乳糖誘導[40?41]等。這些調控元件強度高、穩定性好，但是在發酵過程中需要一定的操作，不適合大多數工業發酵的需求。

2.1.2 酸 在原核生物中，Pasr是常用的質子誘導的啟動子，在大腸桿菌中受PhoQP?RstBA 信號延遲級聯系統的調控，在pH 低于5時強度明顯升高[42?43]，對其轉錄因子結合位點保守序列的突變可獲得一系列誘導強度不同的啟動子庫[44]。PcadBA是在大腸桿菌中發現的另一個酸誘導啟動子，它受到膜信號蛋白CadC 的激活。在培養基中缺少賴氨酸時，賴氨酸轉運蛋白LysP 與CadC 的跨膜域結合，抑制酸信號向啟動子傳遞。因此，截除CadC的跨膜域可消除賴氨酸對PcadBA的干擾[45]。此外，研究者在大腸桿菌中開發了一個乙酸誘導的啟動子PglnAP2s，通過對初始啟動子+1 位置下游序列的截除提高了其嚴謹性和靈敏度[46]。

在酵母中，對轉錄調節元件類型的生物傳感器的研究還較少。研究者表征了一些啟動子對酸或高溫的響應情況，但都缺乏較高的強度和嚴謹性[47]。通過人工啟動子的設計和優化，研究者在一個酸誘導型啟動子PYGP1的基礎上進行改造，將核心啟動子區進行替換以及將上游激活序列（upstream activating sequence，UAS）中的轉錄因子結合位點進行替換和插入，獲得了一個在酸性條件下具有高強度的人工合成啟動子PCCW14[48]。

2.1.3 代謝物 小分子代謝物的生物傳感器可以通過理性設計的方法實現，主要思路是尋找能與目標代謝物產生相互作用的轉錄調節因子。研究者對轉錄調節因子進行了系統性的整理，在數據庫中挖掘了一系列需要配體（小分子代謝物）參與的轉錄調節因子及其作用的啟動子，通過驗證得到了15種代謝物誘導的啟動子，且驗證了它們之間具有很好的正交性，并且在多種原核細胞中對它們進行了驗證[49]。

研究者發現來自枯草芽孢桿菌的轉錄因子FapR對順式調節元件fapO具有抑制作用，而對大腸桿菌的啟動子PGAP有激活作用，并且丙二酰輔酶A可與FapR 結合分別抑制對fapO 和PGAP的作用，因此，分別得到了丙二酰輔酶A 誘導與抑制的啟動子系統[50?51]。

PhucR是在耐輻射球菌（Deinococcus radiodurans）中發現的一個尿酸誘導啟動子，尿酸能與HucR 結合，促進PhucR的轉錄。對HucR 結合口袋的關鍵位點進行飽和突變，篩選得到能夠結合香草醛和阿魏酸的突變體HucR?V7，實現對香草醛和阿魏酸的感應。并對PhucR的?10區進行飽和突變，進一步提高了香草醛的誘導強度[52]。

Keasling 等[53]通過理性設計開發了響應萜類合成重要前體—— 異戊烯焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate，IPP）的人工生物傳感器。在大腸桿菌中，用IPP 異構酶Idi與阿拉伯糖轉錄因子的DNA結合域（AraC?DBD）融合，在無IPP 時，此人工轉錄因子與阿拉伯糖結合并誘導啟動子PBAD；在有IPP時，Idi形成二聚體，無法與啟動子結合，基因停止表達。在酵母中，用Idi 與轉錄因子Gal4 的DNA 結合域（DBD）、DNA 激活域（AD）分別融合，在有IPP 時，Idi 二聚體使DBD 與AD 靠近，激活RNA 聚合酶使PGAL10啟動[圖4（a）][53]。由于酵母與大腸桿菌轉錄機制不同，在酵母中構建完整的系統更為困難。此方法可同樣用于構建其他物質的人工生物傳感器，但需要對靈敏度、嚴謹性和專一性進行精細的調節。利用蛋白質從頭設計的方法，理論上可以得到任何目標化合物的傳感器：將計算機設計的配體結合蛋白分別融合DBD和AD[54]，用此方法實現了地高辛和孕酮的感應[55]。

另一種方法是從轉錄組學中挖掘響應的啟動子。 研究者對積累法尼基焦磷酸（farnesyl pyrophosphate，FPP）的菌株及不積累FPP 的菌株進行轉錄組分析，發現一些顯著上調與下調的基因，因此這些基因的啟動子可作為天然的FPP生物傳感器，例如PgadE為FPP 抑制，PyrbL和PrstA為FPP 誘導[56]。此思路可應用于挖掘各種誘導型轉錄調控元件。

2.1.4 溫度 感應溫度的啟動子一般源于微生物自身的熱激蛋白或冷激蛋白的啟動子。在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中，研究者表征了熱激蛋白啟動子PHSP12和PHSP26在高溫等條件下的啟動強度，其在某些條件下能夠受到高溫的誘導[47]。通過轉錄組挖掘到了一系列高溫誘導型的啟動子，提供了更為全面的啟動子響應高溫變化的數據庫[57]。但是，若想在釀酒酵母中實現控制更加嚴謹的啟動子，還需進一步對啟動子進行人工改造與優化。

λ 噬菌體中的pL/pR?cI857 系統常被用作大腸桿菌中的溫度誘導開關。在低溫時，噬菌體蛋白cI857 形成二聚體，結合在啟動子的oL 或oR 區域，阻礙RNA 聚合酶與啟動子結合；在高溫時，cI857 解離，使啟動子開啟轉錄[58]。

此外，研究者在大腸桿菌中構建了一個控制嚴謹的低溫誘導系統。煙草花葉病毒蛋白酶TEV 能對特定的氨基酸序列進行切割，在來自于噬菌體434 的轉錄抑制因子cI434 中插入TEV 的切割位點。通過定向進化得到低溫抑制的cI434 突變體及高溫抑制的TEV 突變體。因此，在低溫下，TEV 活性高，高效切割cI434，且cI434 活性低，不會抑制PR啟動子，目標蛋白表達；在高溫下，TEV 失活，且cI434 活性高，抑制PR啟動子，目標蛋白不表達。在此基礎上，對目標蛋白融合一個蛋白酶mf?Lon 靶向的標簽，并且用啟動子PR聯合TetR 抑制因子抑制mf?Lon 的表達，這樣使目標蛋白在高溫下可被快速降解，使開關更加嚴謹[圖4（b）][59]。

圖4 轉錄調節元件作為生物傳感器(a)感應IPP的轉錄調節元件的理性設計[53];(b)低溫誘導表達系統[59];(c)大腸桿菌中光誘導和光抑制表達系統[64];(d)釀酒酵母中光誘導表達系統[65]Fig.4 Transcription regulatory elements as biosensors(a)rational design of IPP?response element[53];(b)cold?induced expression system[59];(c)light?induced and light?repressed expression system in E.coli[64];(d)light?induced expression system in S.cerevisiae[65]

2.1.5 細胞密度 群體感應（quorum sensing，QS）起到在細胞之間進行調控的作用。細胞分泌的信息素在達到一定濃度時會通過磷酸化級聯傳遞到一些啟動子，從而調控基因表達水平，例如枯草芽孢桿菌中發現的啟動子PsrfA[60]，對PsrfA保守序列的優化以及上游序列的替換和截除，可以提高啟動子的誘導強度[39]。在微生物中常用海洋細菌費氏弧菌（Vibrio fischeri）中發現的LuxI?LuxR 系統進行群體感應調控。LuxI 可催化合成一種信號分子酰基高絲氨酸內酯（acylhomoserine lactone，AHL），隨著AHL 濃度的升高，AHL 結合并激活轉錄調控因子LuxR，從而誘導啟動子PluxR[61?62]。

2.1.6 光 在深海細菌斜視紅桿菌（Erythrobacter litoralis）中存在一種光敏DNA 結合蛋白EL222，此蛋白包含N 端的光?氧?電壓（light?oxygen?voltage，LOV）結構域和C 端的DNA 結合域，當接收藍光時，EL222可形成二聚體并結合特定的DNA 序列[63]。研究者在大腸桿菌中構建了藍光誘導的啟動子系統。將PluxI啟動子中的反向重復序列替換為EL222 的結合序列，因此EL222 二聚體可結合在PluxI的?35 區并招募RNA 聚合酶，開啟轉錄。同時構建了藍光抑制的 啟 動 子 系 統，將PluxI的?35 至?10 序 列 替 換 為EL222 的結合序列，這樣二聚體結合在此處抑制了RNA 聚合酶與啟動子的結合[圖4（c）][64]。研究者在釀酒酵母中也構建了光誘導和光抑制的系統。將EL222與轉錄激活蛋白VP16的轉錄激活域融合，當接收藍光時，融合蛋白形成二聚體結合到啟動子PC120上開啟基因表達[圖4（d）]。將此系統與半乳糖操縱子系統相結合，用藍光誘導GAL80 的表達，Gal80 最終抑制PGAL1，實現藍光抑制基因表達的效果[65]。同時，研究者還構建了紅光誘導[66]及綠光誘導系統[67?68]。三個系統具有很好的正交性，可以滿足多重誘導的需要。

2.2 翻譯調節元件作為生物傳感器

一些非編碼RNA（non?coding RNA，ncRNA）可以對蛋白質翻譯進行調控，它們一般會影響核糖體與mRNA 的結合，因此也被稱作核糖體開關（riboswitch）。

2.2.1 溫度誘導的核糖體開關 在原核生物中，一些ncRNA 形成的莖環結構可結合在一些基因的5′非翻譯區（5′?untranslated region，5′UTR），阻礙核糖體的翻譯進程，當溫度升高后，ncRNA 與DNA 脫離，開啟翻譯過程。這種ncRNA可稱作RNA溫度計，解離溫度與RNA 溫度計的結構是相關的，因此通過設計不同結構的RNA 溫度計實現了對不同溫度的響應，從而實現在不同的培養溫度下表達不同的蛋白[62,69]。

一些基因的5′UTR 本身也會受溫度的影響而影響其翻譯水平。例如，大腸桿菌中cspA 基因的5′UTR 二級結構受溫度影響，在低溫時，這段RNA的結構使核糖體更容易進行翻譯；而在高溫時，RNA的結構改變，使其難以結合核糖體進行翻譯[70]。2.2.2 pH 誘導的核糖體開關 研究者在大腸桿菌中發現了一個pH 敏感的RNA 元件（pH?responsive RNA element，PRE），位于alx 基因上游的5′UTR。PRE在酸性條件下（pH5.0），其包含的核糖體結合位點（ribosome binding site，RBS）被覆蓋在莖環結構內，無法結合核糖體進行翻譯；在堿性條件下（pH8.0），PRE 的結構發生改變，使RBS 暴露出來并能夠與核糖體結合，從而開啟翻譯[71?72]。通過對RBS 的替換和對RNA 聚合酶的優化使PRE 的作用強度更高、泄露表達更低、pH敏感性更高[73]。

2.3 蛋白質作為生物傳感器

蛋白質類的生物傳感器除了前文提到的pH 誘導的α?螺旋構象變化以外，還包括一些受信號分子調節的熒光蛋白，使其具有在線原位檢測細胞內活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）、谷胱甘肽、NAD(P)H 等物質的功能。這些熒光蛋白探針為實時檢測細胞生長狀態、抗氧化水平和代謝平衡等生理指標提供了重要工具。關于這些熒光蛋白探針的綜述可詳見文獻[74?76]。

另外，蛋白質類的生物傳感器還包括光誘導型的蛋白質聚集/解離元件。來自擬南芥的Cry2 光解酶同源域可在藍光激發下形成寡聚態，通過點突變得到的Cry2olig 可使其聚合度提高，此外，將Cry2 與FUS 蛋白的N 端無序區融合也可提高聚合度，最終得到的融合蛋白FUSN?Cry2olig 可實現靈敏的光誘導聚集[77?79]。通過FUSN?FusionRed?Cry2olig 的蛋白融合，使這一系統在釀酒酵母中可行且可視化[80]。在藍藻（Synechocystis sp.）中發現的PixD和PixE蛋白組成了藍光誘導的PixELL 系統。在無光時，PixD 和PixE 形成多聚物；藍光誘導后，二者解離，PixE 形成單 體，PixD 形 成 二 聚 體[81?82]。在 釀 酒 酵 母 中，將FUSN?FusionRed?PixD 融 合，將FUSN?Citrine?PixE融合，獲得了可視化的光誘導解離系統[80]。

3 代謝調控的智能化

代謝調控的智能化是依靠智能調節基因線路來實現的。智能調節基因線路主要由生物傳感器和效應基因組成，生物傳感器負責接收信號并將信號傳遞給效應基因，再由效應基因產生作用蛋白，從而實現對信號的反饋（震蕩）、增強等調節，或實現其他生物過程。根據智能調節基因線路的作用可分為提高產物產量和提高菌株魯棒性；根據智能調節基因線路的復雜程度可分為單一基因線路和邏輯門；根據智能調節基因線路的調控方式可分為一般動態調控和自主動態調控。

3.1 一般動態調控

一般動態調控是指在發酵過程中需要人工操作誘導條件來達到調控基因線路及細胞狀態的過程。例如，用酸誘導啟動子Pasr和低溫誘導啟動子PcspA分別調控轉錄因子基因invF 和分子伴侶基因sicA，InvF 與SicA 形成的復合物可激活啟動子PsicA，在發酵過程中形成一個雙重誘導的“與門”；而用PsicA調控目標基因的反義RNA，則可以抑制目標蛋白的翻譯，形成一個“與非門”[44]。

CRISPRa/i 是目前常用于動態調控的工具。研究者在大腸桿菌中構建了由鼠李糖誘導型啟動子PrhaPBAD誘導dCas9 來進行轉錄抑制的CRISPRi 系統。通過dCas9 抑制基因mvaE 和mvaK1 調節了甲羥戊酸途徑的代謝通量，使番茄紅素的產量增加了8倍[83]。研究者利用脫落酸介導的ABI?PYL1 蛋白質相互作用，設計了兩個融合蛋白MCP?ABI和PYL1?VP64，通過添加脫落酸使MCP與VP64融合，進而招募RNA 聚合酶，實現CRISPRa 的動態調控過程[84]。另外，還可以在翻譯水平對dCas9 的表達進行調控，在dCas9 基因中引入一個TAG 終止密碼子，該位點可被翻譯為一個合成型非天然氨基酸L?聯苯丙氨酸（L?biphenylalanine，BipA）。當加入BipA 時，TAG可被翻譯，從而產生完整的有功能的dCas9 蛋白；當沒有BipA 時，翻譯會在TAG 處中斷，產生截短的無功能的dCas9 蛋白，從而失去對目標基因的抑制作用[85]。

但是，上述這種需要改變培養基成分的調控方式很難用于工業生產，因此需要一些可行的動態調控手段，如光誘導等。用藍光調控釀酒酵母生產異丁醇，由于乙醇和異丁醇的合成存在競爭前體物丙酮酸的關系，需要抑制乙醇的產生，但乙醇合成途徑中的丙酮酸脫羧酶是生長必需的，完全敲除會導致細胞無法生長。因此，設計用藍光誘導丙酮酸脫羧酶表達，用藍光抑制異丁醇合成關鍵基因ILV2 的表達，在發酵前期開啟藍光，使細胞生長，而在中后期關閉藍光或根據生長提供脈沖光源，這種方法使異丁醇的產量提高了5倍[65]。

VioE 催化生成原脫氧紫色桿菌素（protodeoxyviolaceinate，PTDV），再經VioC 催化生成脫氧紫色桿菌素（deoxyviolacein，DV，粉色）。但PTDV 容易自發被氧化產生前脫氧紫色桿菌素（prodeoxyviolacein，PDV，綠色）。因此，要提高脫氧紫色桿菌素的產量就要精確控制VioE 和VioC。通過光誘導聚集，用Cry2olig 分別與VioE 和VioC 融合，藍光誘導使VioE 和VioC 拉近距離，這樣避免了PTDV 的積累，提高DV 的轉化率；類似地，通過光誘導解離，將PixD 和PixE 分別與VioE和VioC融合，在無藍光下PixD 與PixE 聚合，拉近VioE 和VioC 的距離。此方法使合成DV的特異性提高了18倍[80]。

調節反應溫度和pH 等條件控制酶活，可以達到改變催化產物的目的。例如，在阿魏酸轉化香草醛的過程中設計了新的不依賴輔酶的催化過程，通過酚酸脫羧酶Pad催化香草醛生成中間產物對乙烯基愈創木酚，再通過芳香雙加氧酶Ado 催化產生香草醛。由于受細胞內源的乙醇脫氫酶影響，一部分香草醛轉化為了香草醇，為防止這種副反應產生，將反應溫度提高至50°C，可使大部分乙醇脫氫酶失活。在提高溫度的同時提高pH 至9.5，由于Ado 催化的反應為限速步驟，Ado在堿性下活性更強，且堿性進一步降低乙醇脫氫酶活性，使目標產物香草醛的轉化率明顯提高。因此，實現了通過溫度和pH的調節改變產物比例的目的[86]。

3.2 自主動態調控

自主動態調控是指在發酵過程中不需要人工操作干預，菌株可自動根據發酵條件變化調節自身狀態的過程。

3.2.1 自主動態調控在產物合成中的應用 在產物合成的自主動態調控中，常會將積累量高的中間代謝物作為誘導物來負反饋抑制上游代謝途徑的基因，正反饋誘導下游代謝途徑的基因。例如，在青蒿素前體紫穗槐二烯的生物合成途徑中，FPP 為毒性中間產物，它的積累導致細胞生長和生產受到影響。通過前文所述的FPP抑制的啟動子和FPP誘導的啟動子來分別調控FPP上游途徑基因和下游途徑基因，分別形成反饋抑制和反饋誘導，通過FPP的量誘導FPP自身的轉化，降低了FPP的積累，提高了產物產量。此方法對比傳統的利用IPTG 誘導的調控方法更加智能，調控更加準確，產量提高更明顯[圖5（a）][56]。類似地，在脂肪酸的合成途徑中，利用丙二酰輔酶A誘導與抑制的啟動子分別對其下游和上游基因進行調控，使丙二酰輔酶A 的積累量處于動態平衡，提高了脂肪酸的產量[50]。另外，在利用木糖合成1,2,4?丁三醇的途徑中，木糖酸是一個毒性中間代謝物。利用酸誘導的啟動子PcadBA與LacI 轉錄因子形成一個“非門”調控木糖酸合成基因xdh 和xylC，木糖酸濃度的提高會誘導PcadBA，進而抑制木糖酸合成基因的表達，形成反饋抑制[87]。研究者還挖掘到了木糖酸誘導的啟動子PyjhI，用其誘導表達木糖酸下游途徑的基因[88]，這兩種調節均降低了木糖酸的積累，提高了終產物的產量。

在阿魏酸轉化香草醛的途徑中，用香草醛誘導的啟動子控制香草醛的合成基因，使其在發酵前期香草醛合成速率慢，隨著香草醛量的增加，不斷誘導香草醛的合成。這種方法使細胞在發酵前期避免香草醛的毒性，積累更高的生物量，而在發酵后期香草醛產量更高[52]。通過群體感應誘導系統也可以實現發酵前期積累生物量、發酵后期誘導產物高效合成的效果[89?90]。

另一方面是對競爭途徑的自主動態調控。FPP是生產各種萜類物質的重要前體，在釀酒酵母中很大一部分的FPP 都被用于合成麥角固醇，用于維持細胞正常生長，但這與目標途徑形成了競爭。完全敲除FPP 轉化麥角固醇的基因ERG9 會導致細胞無法生長，因此一般都會考慮抑制ERG9 的轉錄水平。研究發現麥角固醇會對合成它的基因的啟動子PERG1形成反饋抑制，因此可以用PERG1調控ERG9，使麥角固醇合成途徑處于反饋調節的狀態，這就減少了FPP 向麥角固醇的合成，使紫穗槐二烯的產量明顯提高，并且同時維持菌株良好的生長[圖5(b）][91]。

3.2.2 自主動態調控在提高細胞魯棒性中的應用乙酸是對細胞毒性較強的代謝物之一，在乙酸合成過量的情況下需要抑制乙酸的合成途徑。研究者利用乙酸誘導的啟動子PglnAP2s、葡萄糖誘導的啟動子PgluA7以及溶氧抑制的啟動子PfnrF8構建了多種邏輯門，由于發酵過程中乙酸濃度、葡萄糖濃度和溶氧濃度均隨時間變化，因此通過多種邏輯門可得到一系列不同的動態輸出信號。根據發酵中后期抑制乙酸合成的要求，選擇適當的邏輯門對乙酸合成基因進行了動態抑制，極大地降低了乙酸在細胞內的含量[46]。

熱激蛋白起到防止蛋白質在高溫下錯誤折疊或聚集的作用，而且不同的熱激蛋白對不同溫度下蛋白質的保護作用也是不同的。利用響應不同溫度的RNA 溫度計來調節不同熱激蛋白的過表達，可實現熱激蛋白的梯級表達，降低細胞的表達負擔。另外，利用群體感應啟動子調控自殺基因，可使細胞維持在一定的數量，防止細胞濃度過高導致產熱效應和過早進入衰亡期[62]。

在細胞工廠中，異源表達往往對底盤細胞形成負擔，使細胞生長水平降低。研究者在大腸桿菌中分析了表達異源基因對細胞轉錄組的影響，發現表達異源基因使大部分熱激蛋白基因顯著上調。據此構建了通過CRISPRi 自主調節細胞負擔的系統，用上調最為顯著基因的啟動子PhtpG1控制靶向異源基因的gRNA，用組成型啟動子表達dCas9，當異源基因表達過高時，gRNA 的表達也會提高，進而反饋抑制異源基因的表達，使細胞的生長和生產處于平衡狀態，提高產物的產量[圖5（c）][92]。利用轉錄組挖掘到的高溫誘導啟動子和乙酸誘導啟動子分別對釀酒酵母谷胱甘肽抗氧化系統和乙酸降解途徑進行強化，使ROS 和乙酸可以對啟動子進行自主的反饋調節，不但提高了細胞魯棒性和乙醇產量，還可以降低過表達造成的負擔[圖5（d）][57]。

圖5 自主動態調控策略(a)FPP反饋抑制與反饋誘導提高紫穗槐二烯產量[56];(b)麥角固醇反饋抑制降低競爭途徑通量[91];(c)轉錄負擔誘導的CRISPRi反饋調節[92];(d)脅迫誘導的抗脅迫反饋調節[57];(e)二次酸感應細胞死亡系統[93]Fig.5 Autonomous dynamic regulations(a)FPP feedback inhibition and induction increase amorphadiene production[56];(b)ergosterol feedback inhibition decreases competitive pathway flux[91];(c)burden induced CRISPRi feedback regulation[92];(d)stress?driven feedback regulation of anti?stress system[57];(e)two count pH sensitive kill switch[93]

研究者構建了一個酸誘導的細胞死亡系統。用酸誘導啟動子Pasr調控毒蛋白Doc 的表達。通過對啟動子強度的優化使得細胞在pH7.0 穩定生長，而在pH5.0 時停止生長。在此基礎上，通過復雜的基因線路實現了細胞在二次酸性下死亡的過程，基因線路包括觸發線路和效應線路[圖5（e）]。在初始的中性pH 環境中，cI抑制啟動子PR和PRM；當菌株處于酸性脅迫下，誘導cro的表達，高濃度的cro可同時抑制PRM和PR，當pH 恢復到中性時，低濃度的cro 只抑制PRM，PR開啟xis 和int 的表達。Xis?Int 可將attL和attR 之間的序列切除；在第二次酸誘導下，doc 可以表達，并抑制細胞生長[93]。將致死基因doc替換為熒光蛋白基因，可實現對酸脅迫的計數[93]。

3.2.3 自絮凝實現細胞分離的智能化 在釀酒酵母及運動發酵單胞菌（Zymomonas mobilis）等菌株中都存在細胞絮凝機制，在發酵后期開啟細胞絮凝，可使細胞與發酵液自動分離，簡化分離過程，降低生產成本[94]。在釀酒酵母中，用高溫誘導型啟動子PHSP30或乙醇誘導型啟動子PTPS1強化絮凝基因FLO1/5/11 的表達，實現了細胞在發酵后期隨著溫度或乙醇濃度的升高自動絮凝[95?96]。

坎帕尼亞鹽單胞菌（Halomonas campaniensis）的耐鹽和耐堿性使其非常有望被用于工業，實現發酵廢水的循環使用及開放的發酵模式。通過敲除電子傳遞鏈中的基因etf，提高細胞表面的疏水性，使細胞實現自絮凝過程，不僅實現了發酵廢液的多次循環使用，還提高了發酵產物聚?3?羥基丁酸酯（poly?3?hydroxybutyrate，PHB）的產量[97]。

4 菌株的智能進化

除了理性地構建智能調控菌株以外，菌株進化過程的智能化也越來越多地被發現。智能進化可以分為基于生物傳感器的自主進化和基于高通量突變體庫的智能進化，前者相較于后者更加智能、更具針對性。以下將介紹一些經典的智能進化方法。

4.1 智能自主進化提高目標化合物產量

基于生物傳感器的自主進化一般要求生物傳感器的特異性較強，避免結構類似物對生物傳感器和進化過程造成干擾。為了提高目標產物的產量，研究者發明了反饋調節的菌株進化系統（feedback?regulated evolution of phenotype，FREP）[53]。系 統 包括三個模塊：①能夠與產物結合并改變與啟動子結合力的轉錄因子；②轉錄因子所調控的啟動子；③誘變基因dnaQ。當產物濃度低時，無產物結合在轉錄因子上，啟動子開啟誘變基因表達，使基因組進行隨機突變，基因組的突變可獲得高產菌株，高產菌株中產物與轉錄因子相結合，從而抑制啟動子，停止誘變基因的繼續表達。研究者在大腸桿菌中用酪氨酸結合的轉錄因子TyrR調節啟動子ParoF的開關，得到了高產酪氨酸的突變株[圖6（a）][53]。用前文所述的IPP 響應元件控制誘變基因的表達，篩選得到了高產IPP和番茄紅素的菌株[53]。

4.2 智能自主進化提高菌株魯棒性

研究者在枯草芽孢桿菌中開發了一種自主進化 系 統（autonomous evolution mutation system，AEMS），成功提高了菌株耐受乙偶姻的水平。將群體感應誘導的啟動子PsrfA與木糖誘導系統組合成“與門”開關，用其控制ssbA、bstG（誘變基因）和sspB（識別ssrA 標簽并降解此標記蛋白）。另一條基因線路中用IPTG 誘導系統控制融合ssrA 標簽的mutL和alkA（編碼高保真修復酶）。在自主進化的開始加入IPTG 和木糖，高保真修復酶表達，使細胞正常生長到一定密度，之后高密度誘導誘變基因表達，并降解高保真修復酶，使基因組突變[圖6（b）]。在高濃度乙偶姻下篩選得到耐受菌株[39]。此方法實現了菌株自發的突變，不需要控制外部條件，避免了傳統誘變致死率高、效率低等問題。

類似地，研究者利用前文所述的pH 調節的核糖體開關PRE 也實現了菌株的自主進化，提高了菌株在酸性條件下的魯棒性。用PRE 調控基因int2（編碼一個整合酶使attB 和attP 之間的序列翻轉）的表達，在attB 和attP 之間插入一個組成型啟動子，而在attB 和attP 兩側分別是誘變基因ednaQ 和熒光蛋白基因rfp。當細胞處于酸性環境時，PRE 處于關閉狀態，ednaQ 表達并引起基因組突變，當突變株獲得了抵抗酸性的能力時，細胞質的pH 上升，使PRE 開啟int2 的表達，從而使啟動子方向發生改變，開啟rfp 的表達[圖6（c）]。通過挑選帶有紅色熒光的菌落，即可得到耐酸的菌株[73]。

4.3 基于高通量突變體庫的智能進化

研究者發明了一種在體內合成CRISPR RNA（crRNA）文庫的方法（CRISPR adaptation?mediated library manufacturing，CALM）。利用產膿鏈球菌Streptococcus pyogenes 自身的CRISPR 防御機制，將合成crRNA 的基因元件移植到其他菌株中，其中包括間隔重復序列，反義crRNA 以及Cas 蛋白基因hdcas9、cas1、cas2和csn2[98]。將目標基因組的碎片轉化到此工程菌中，可使工程菌自動獲得crRNA 文庫，測序表明文庫覆蓋了約95%可靶向的位置。用此方法篩選得到耐受氨基糖苷類抗生素的菌株[99]。

圖6 基于生物傳感器的智能自主進化策略(a)FREP[53];(b)AEMS[39];(c)利用pH感應的核糖體開關的自主進化[73]Fig.6 Intelligent autonomous evolutions(a)FREP[53];(b)AEMS[39];(c)autonomous evolution based on pH?sensitive riboswitch[73]

人工合成酵母基因組（Sc2.0）通過在基因的3′UTR 處插入loxPsym 序列使得人工合成的基因組容易 編 輯 與 進 化[100?102]。 SCRaMbLE（synthetic chromosome rearrangement and modification by loxP?mediated evolution）就是通過重組酶Cre 的介導使兩個loxPsym 之間的序列發生刪除、倒置或翻倍等事件（圖7）。通過用半乳糖和β?雌二醇構成的“與門”開關提高Cre 表達的嚴謹性，使得SCRaMbLE 能夠被精確控制[103]。另外，光控誘導Cre 重組酶的表達可以使誘導更嚴謹、強度更高、開關更可控[104]。研究者在SCRaMbLE 處理后篩選到耐堿性的菌株[105]。通過將合成型染色體酵母與其他單倍體酵母雜交形成雜合二倍體，再進行SCRaMbLE，可以更快速和高效地篩選得到耐高溫和耐咖啡因的菌株，這種方法降低了SCRaMbLE的致死率[106]。研究者開發了反向雙篩選標記的SCRaMbLE 系統ReSCuES（reporter of SCRaMbLEd cells using efficient selection），這種方法避免了假陽性菌落的出現，通過此方法篩選得到耐受乙醇、耐受高溫以及耐受乙酸的菌株[107]。SCRaMbLE 同樣可以應用于生產異源天然產物中，可以將外源途徑的基因線路通過質粒[108?109]或基因組整合[103,110?111]的方式構建到合成型染色體酵母中，開啟SCRaMbLE 后篩選高產菌株，并測序研究合成型染色體基因型的變化與表型的關系。目前通過SCRaMbLE 已成功提高了β?胡蘿卜素、紫色桿菌素及樺木酸的產量。進一步，研究者還開發了SCRaMbLE?in 的策略，即在體外首先構建好代謝途徑的文庫，再通過轉化和SCRaMbLE 同時進行使基因線路文庫整合到合成型染色體上，實現外源基因線路與合成型染色體的共同進化，此方法比整合到基因組單拷貝位點的產量提高了2～10倍[112]。

圖7 SCRaMbLE作用原理Fig.7 Mechanism of SCRaMbLE

5 發酵過程的智能化

發酵過程的智能化主要體現在發酵工廠的在線控制和實驗室研究中的微流控兩方面。

5.1 發酵控制的智能化

發酵過程中的數據采集和自動化控制是決定其智能程度的關鍵（圖8）。通過越來越多的在線傳感器的開發，計算機可以獲得更多的發酵過程參數，并利用大數據分析來更好地控制發酵條件。除了常規的發酵參數，近年來還開發了能夠檢測發酵尾氣（氧氣和二氧化碳等）、活細胞數量、小分子代謝物等參數的在線傳感器[113]。通過多尺度、在線的參數檢測和控制，可以提高產物在中試以及工業級規模發酵罐中的產量[114?115]。

工業發酵罐中控制參數的不均一性和時變性給發酵控制增加了難度，并且細胞未處于發酵最佳條件嚴重降低了發酵產量。通過基于神經網絡的在線自學習的溫度控制方法，可以提高發酵罐中溫度控制的精確程度，并且使多段溫度控制更加穩定[116]。發酵過程的補料策略同樣影響發酵產量，例如，如何添加甘油使1,3?丙二醇的產量最大化，研究者通過將蒙特卡羅抽樣與路徑積分相結合的改進粒子群算法來優化控制方法，提高了產物的濃度[117]。

5.2 微流控技術

近年來，微流控技術被廣泛應用于微型發酵實驗以及高通量篩選和高通量測序，具有可控性強、自動化和通量高的特點。目前能夠實現利用全自動的微流控操作平臺進行單細胞的篩選和檢測[118?119]。微流控技術與單細胞測序技術相結合[120?121]不僅提高了測序通量，而且可以解決微生物培養中的細胞分化、混菌互作關系等難以解決的科學問題。

6 結論與展望

智能化的生物制造逐漸地受到人們的關注，其對工業發酵生產過程將起到革命性的作用。本文從蛋白質設計、生物傳感器、基因線路、菌株進化和發酵過程五個層面對智能生物制造進行了介紹和解析。在蛋白質設計的智能化層面，調節蛋白的設計取得了一些重要突破，獲得了大量調節蛋白用于細胞調控。而要想實現任意功能的酶的從頭設計這一終極目標，繼續發展計算機的智能設計方法將是必經之路。對酶的催化選擇性、條件選擇性機制的解析可以幫助人們更深入地理解酶分子設計，實現酶的智能設計。在生物傳感器的智能化層面，已經開發了多種響應不同信號的生物傳感器，包括轉錄調節、翻譯調節相關的以及蛋白質類的生物傳感器。生物傳感器的穩定性、嚴謹性、靈敏度、檢測范圍等指標是評價其能否被應用到實際生產中的重要標準。對生物傳感器響應信號的拓展以及性能的優化將是實現智能生物制造過程的重要基礎。在代謝調控的智能化層面，細胞完全自主的動態調控優于傳統的動態調控方式。在各種生物傳感器的基礎上，實現對代謝途徑或魯棒性的自主調節，將對降低發酵過程的生產成本和提高產量起到重要作用。在菌株的智能進化層面，基于生物傳感器的自主進化一般要求生物傳感器的特異性較強，避免結構類似物對生物傳感器和進化過程造成干擾。因此，開發重要產物的生物傳感器是至關重要的。另外，借助智能化高通量的機器人，煩瑣的高重復度的生化實驗將逐漸被智能化機器人取代。高通量組裝與篩選平臺已越來越多地被應用[22,122]，并且高通量的化合物檢測平臺[111]的應用也是替代生物傳感器的一種方案，并且更具普適性。在發酵過程的智能化層面，工業級發酵的多參數在線傳感器、大數據分析和優化控制方法，以及實驗室規模下微流控發酵技術的發展將是未來智能發酵過程的發展方向。

圖8 發酵工廠的智能化Fig.8 Intelligence of fermentation control