體外循環法對犬骨骼肌缺血再灌注損傷的保護作用

周 強，童梁成，薛 慶，王國軍，劉 琨，夏志強，李 穎

骨骼肌缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury, IRI)是臨床常見的一種外科并發癥，多見于骨筋膜室綜合征、擠壓綜合征、血管損傷和外周血管病等多種疾病[1，2]。目前，一些臨床手段已廣泛應用于其治療，包括高壓氧、藥物干預、缺血預處理和缺血后處理等，但仍需進一步評價其作用方式和機制[3，4]。探索新的臨床治療策略，改善患者術后生活質量，是目前亟待解決的臨床問題。

研究發現，缺血再灌注損傷的程度與氧自由基、炎性介質的釋放密切相關，且體外循環可以影響組織缺血再灌注損傷程度[5-8]。但體外循環灌注是否可以減輕內皮細胞損傷、減少炎性因子釋放、減少自由基的生成等病理過程，對犬骨骼肌缺血再灌注損傷是否具有一定的保護作用，仍有待進一步的研究。

本實驗通過建立犬骨骼肌缺血再灌注損傷模型，通過HE染色法觀察組織炎性細胞浸潤，利用TUNEL法觀察組織凋亡的變化，借助特異性的試劑檢測血清中LD、SOD等酶的變化，并通過ELISA法檢測組織中血清中IL-10和TNF-α等細胞因子的變化，從而評價ECC法再灌注模式對犬骨骼肌缺血再灌注損傷的保護作用，為臨床相關疾病的治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料及設備 實驗動物比格犬購于常州貝樂實驗動物養殖有限公司。體重10～15 kg，犬齡2～5歲，共27只，隨機分為對照組、模型組和ECC組，每組9只。鐵蘇木素購于武漢谷歌生物科技有限公司。SOD，LD試劑盒購于江蘇晶美公司。TNF-α，IL-10 ELISA試劑盒購于Abcam公司。

1.2 犬骨骼肌缺血再灌注損傷模型建立 建立犬骨骼肌缺血再灌注損傷模型：術前12 h禁飲食，3%戊巴比妥麻醉犬后(腹腔內麻醉，30 mg/kg)，仰臥位固定于操作臺；左側后肢自腹股溝處平行股動靜脈處，逐層切開皮膚及皮下組織，顯露股動靜脈、旋髂淺支、腹壁淺支及肌支血管，結扎腹壁淺支及肌支血管，自旋髂淺支下緣結扎股動靜脈，傷口無菌敷料包扎，常溫下曠置。對照組動物，結扎離斷6 h后予以通血。模型灌注組動物，結扎5 h后予以灌注(350 ml NaCl，7.5 ml KCl，7 ml NaHCO3,130 ml 10%葡萄糖，磷酸肌酸鈉)灌注1 h后通血；ECC組動物，結扎后5 h后予以行ECC灌注，1 h后通血。經股動脈插入灌洗管，自股動脈近端插入5 mm，用3-0絲線固定，接灌洗液，用靜脈輸液泵以50 ml/h的速度持續灌注，直至近端清創完畢；然后予以吻合股動、靜脈，重建血循環，分別檢測各項指標的變化。

1.3 HE染色法觀察組織炎性細胞浸潤 按照上述分組，分別取各組犬骨骼肌新鮮組織，4%多聚甲醛固定24 h。組織塊梯度乙醇進行脫水，75%乙醇4 h，85%乙醇2 h，90%乙醇 2 h，95%乙醇 1 h，無水乙醇Ⅰ處理30 min，無水乙醇Ⅱ處理30 min，醇苯處理5～10 min，二甲苯Ⅰ處理5～10 min，二甲苯Ⅱ處理5～10 min。組織塊包埋于蠟塊中，修整后-20°冷凍切片，片厚 4 μm。上述石蠟切片經過二甲苯和乙醇脫蠟處理后HE染色。蘇木精染色15 min，漂洗10～30 s后0.5%伊紅液染色 3 min后漂洗2 min。上述切片經過脫水處理，50%乙醇 1～2 s，70%乙醇 1～2 s，80%乙醇 1～2 s，無水乙醇 5～10 min，二甲苯(I)2 min，中性樹膠封片，置于顯微鏡下觀察，圖像采集結果，分析各組間差異。

1.4 TUNEL法觀察組織凋亡的變化 按照上述分組，分別取各組犬骨骼肌新鮮組織，按上述操作過程制備組織切片，經過二甲苯和乙醇脫蠟處理后TUNEL法染色處理，切片脫水后置于顯微鏡下觀察，圖像采集結果，分析各組間差異。

1.5 檢測血清中指標的變化 按照上述分組，制備血清樣品，按照試劑盒的操作要求，處理各組樣品。生化檢測法檢測各組織中LD、SOD等酶的變化，分析各組間差異。ELISA法檢測組織中TNF-α、IL-10等細胞因子的變化，分析各組間差異。

2 結 果

2.1 骨骼肌缺血再灌注損傷模型建立 成功建立犬骨骼肌缺血再灌注損傷模型(圖1)。

圖1 犬骨骼肌缺血再灌注損傷模型

2.2 組織炎性細胞浸潤 HE染色實驗結果表明，與對照組相比較，模型組動物的組織炎性細胞浸潤明顯，提示缺血再灌注損傷可引起組織的炎性反應；經ECC法灌注的動物，其組織炎性細胞浸潤程度顯著低于其他灌注組動物(圖2)。

圖2 犬缺血再灌注模型組織炎性細胞浸潤情況(HE，×200)

2.3 組織凋亡的變化 TUNEL染色實驗結果表明(圖3)，與對照組比較，模型組動物組織的細胞凋亡顯著增加，提示缺血再灌注可誘導細胞凋亡的發生，引起局部組織損傷；經ECC法灌注的動物，其組織的細胞凋亡程度顯著低于其他灌注組動物。

圖3 TUNEL法犬骨骼肌缺血組織凋亡的變化(×200)

2.4 檢測血清中指標的變化 通過特異性的試劑盒，檢測血清中LD、SOD含量的變化。與對照組相比較，模型組動物血清中上述酶的含量顯著增加，且差異均有統計學意義(P<0.01)，提示缺血再灌注可引起局部組織損傷；經ECC法灌注的動物，其血清中上述酶低于其他灌注組動物(P<0.05)。

ELISA法檢測組織中IL-10和TNF-α的變化。與對照組相比較，模型組動物血清中上述細胞因子的含量顯著增加，差異也均有統計學意義(P<0.01)；經ECC法灌注的動物，其血清中上述細胞因子均低于其他灌注組動物(P<0.05，表1)。

表1 犬骨骼肌缺血再灌注損傷血清指標的變化

3 討 論

骨骼肌缺血再灌注損傷是一個復雜的病理過程，涉及氧自由基損傷、鈣超載、炎性反應等機制[9]。骨骼肌缺血再灌注損傷是目前骨科創傷中常見問題，在止血帶損傷、嚴重肢體創傷、大肢體離斷傷等疾病中廣泛存在，目前仍缺乏有效的手段減輕缺血再灌注損傷對骨骼肌的損害。研究表明，骨骼肌缺血再灌注損傷過程中，氧自由基起著重要的調節作用，活性氧和激活的中性粒細胞是主要的影響因素，通過激活環氧化酶和脂質過氧化酶轉運金屬離子的通路，增加周圍組織的脂質過氧化反應，誘導細胞因子的釋放，如前列腺素類、血栓素、白介素等，進而促進和加重局部組織的炎性反應。巨噬細胞釋放水解蛋白酶和活性氧自由基，會加重局部炎癥和組織的損傷，從而阻斷一氧化氮合成酶的活性，減少了一氧化氮的合成，促進細胞的凋亡。此外，還可以促進氧自由基轉變成羥基自由基，細胞膜的結構的由于膜脂質過氧化而收到損傷，加劇缺血組織的進一步受損[10，11]。進一步研究骨骼肌缺血再灌注損傷的病理機制，尋找能夠緩解或阻斷缺血再灌注損傷進程的干預因素，為臨床工作提供更好的指導，提高骨骼肌損傷的治療效果。

骨骼肌對缺血較為敏感，在缺血期及恢復血流后都會出現骨骼肌損傷[12]。通常情況下，骨骼肌能夠耐受2 h缺血而不產生永久損傷；如果缺血持續2～4 h，會發生一些可逆性細胞損傷；但6 h及以上的缺血則會引起骨骼肌出現不可逆的組織壞死[13]。研究發現，體外循環均可影響缺血再灌注損傷的程度，但其具體作用尚未完全闡明。本研究中，首先建立犬骨骼肌缺血再灌注損傷模型，選擇ECC灌注方法，觀察其對缺血再灌注損傷的保護作用。通過對組織病理檢測以及形態學觀察發現，模型組骨骼肌組織內肌細胞水腫、肌纖維溶解斷裂、結構紊亂，炎性細胞浸潤明顯；而ECC法再灌注處理的動物，其組織炎性反應程度顯著低于其他模型組動物。

近年來，國內外諸多學者認為缺血再灌注損傷有細胞凋亡機制參與[14,15]。檢測結果顯示：與對照組相比較，模型組動物組織的細胞凋亡顯著增加，經ECC法灌注后骨骼肌細胞凋亡有所減少。缺血再灌注損傷中自由基損傷及脂質過氧化反應是引起組織損傷的重要機制。氧自由基、鈣超載等因素參與了上述病理過程，與內皮細胞損傷、組織中炎性介質的釋放密切相關[16-19]。王飛等[20]發現，低溫等灌注方式對于離斷的肢體有延長再植時間，減少斷肢代謝，減少缺血再灌注損傷的作用。蔣繼亮等[21]發現，早期通血、導管灌注、防治缺血再灌注損傷等進行再植手術能提高再植成功率；術后早期功能康復訓練能促進患肢功能恢復。文獻[22，23]認為，在大肢體再植中應用體外循環技術可以顯著降低手術中的風險，提高再植肢體的功能和成功率，是一個有用和有效的方法，值得進一步深入研究和推廣。SOD是一種能有效清除自由基的特異性酶，通過歧化反應快速催化超氧陰離子轉化為O2和H2O2，防止超氧陰離子在體內堆積產生毒性，進而清除自由基保護細胞[24]。檢測組織的SOD活力，能夠了解組織對自由基的清除能力和抗氧化能力。實驗結果顯示：模型組動物的血清中LD、SOD等酶的水平顯著增加，而ECC法再灌注處理的動物，血清中上述酶的水平則顯著降低，差異均有統計學意義。

適當的炎性反應可將細胞因子水平維持在適當的水平，有利于細胞免疫和機體恢復；如果炎性因子過度釋放和調節失控，則會誘發全身炎性反應綜合征。TNF-α是參與創傷后機體炎性反應的主要細胞因子之一[25]。我們推測，在缺血再灌注損傷中，ECC法可以有效減少炎性因子釋放，下調炎性反應，從而減少缺血再灌注損傷引起的一系列后果。本研究結果顯示，模型組動物的血清中IL-10和TNF-α等細胞因子的含量顯著增加，而ECC法再灌注處理的動物，其水平則顯著降低。

以上結果均表明，ECC法再灌注模式對犬骨骼肌缺血再灌注損傷具有一定的保護作用。ECC法通過減輕骨骼肌組織炎性細胞浸潤程度，降低損傷骨骼肌細胞的凋亡率，降低LD、SOD等酶的活力和血清中IL-10和TNF-α等細胞因子的含量，從而達到對犬骨骼肌缺血再灌注損傷的保護作用。本研究為臨床相關疾病的治療提供了一定的實驗依據和新的策略。