聲遺傳技術的研究進展

王天歌

(天津大學生命科學學院，天津 300072)

超聲波是一種在醫學領域得到普遍認可的物理媒介，具有安全性高、成本低、應用便捷等獨特優勢，目前已在臨床的各個領域得到了廣泛應用，涉及各類器官和醫學分支，例如用于醫學成像和診斷的低強度超聲波以及用于擊碎結石和腫瘤組織等的高強度超聲波。近年來，隨著國家提出要滿足重大疾病早期診療的要求，同時結合物理和工程等學科的技術發展，已經開發出很多基于超聲波的新型技術，聲遺傳技術也隨之應運而生。這一技術的思路來自于光遺傳技術，光遺傳技術是通過激光調控光敏蛋白進而調控細胞活動的一種新興技術，近年來備受關注并且在神經科學等領域取得了很多研究成果[1-2]。然而由于光遺傳技術利用激光作為細胞調控手段，仍然存在一些需要改善的問題，如穿透性低、定位不夠精準、需要手術植入光纖以及激光熱效應較強等[3-4]。聲遺傳技術憑借特有的非侵入性、精準調控性、高安全性等優勢[5-6]，能夠彌補光遺傳技術的一些缺陷，有望成為繼其之后極有發展前景的一項細胞調控技術。

聲遺傳技術的原理(圖1)主要是：通過基因工程技術將機械敏感通道蛋白的基因轉入目的細胞，利用超聲波調控細胞特異性表達的機械敏感通道蛋白進而調控細胞的行為活動。其中所用的機械敏感通道蛋白可以感受超聲波產生的機械力從而打開通道，使細胞內外的小分子主要是離子通過通道流動，離子在細胞的很多重要行為活動中都起著關鍵的調控作用，因此通過不同的通道蛋白調控不同的離子流動即可調控相應的細胞行為。目前已經研究發現的機械敏感通道蛋白的種類有很多，但應用于聲遺傳技術研究的僅有幾種，主要包括大電導機械敏感離子通道(mechanosensitive channel of large conductance，MscL)、瞬時受體電位(transient receptor potential，TRP)離子通道、雙孔鉀通道家族(channels of the two-pore-domain potassium family，K2P)和Piezo離子通道等[7]。它們大多數都能夠對低強度的超聲波產生響應，因此，聲遺傳技術中所使用的超聲波對機體的損傷極小。作者對聲遺傳技術的應用進行綜述，包括神經細胞調控、目的基因表達調控及腫瘤細胞死亡調控等方面，并對聲遺傳技術面臨的機遇和挑戰進行分析，以期為聲遺傳技術的進一步深入研究和發展提供參考。

圖1 聲遺傳技術原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of principle of sonogenetics technology

1 聲遺傳技術的應用

目前，對各類機械敏感通道蛋白的分子結構及開放機理等特性已經研究的比較透徹，并且在構建性能更好的突變體蛋白方面也得到了一定的發展，通道蛋白在動物細胞中的表達和對超聲波的響應性也得到了驗證。如Doerner等[8]證明了來源于原核生物的 MscL野生型和突變體蛋白可以在哺乳動物細胞中成功表達并發揮作用；Heureaux等[9]利用偶聯到細胞表面的微泡對超聲波強度的放大作用，成功通過低強度超聲波調控MscL的開放。這些研究為聲遺傳技術在各方面的應用奠定了重要的基礎。

1.1 在神經細胞調控方面的應用

聲遺傳技術最先在調控神經細胞放電領域得到應用。超聲波作為損傷極小、穿透能力很強的介質用于刺激神經元放電具有很大的優勢，可以安全傳入大腦深層。研究者曾單獨使用超聲波來刺激幾種模型生物的大腦神經元簇，但作用范圍較廣，無法刺激單個神經元細胞，精確度很低[10-12]。利用聲遺傳技術能夠通過打開特定離子通道來激活特定的神經細胞，雖然目前只停留在低等生物個體與哺乳動物細胞層面，但有望為大腦神經調控提供一種精確度高、調控效果好的新策略。

1.1.1 激活神經元

Ibsen等[13]研究了在線蟲神經元上表達的TRP-4通道蛋白對低強度超聲波的響應性，以及由此產生的神經元激活和線蟲行為活動改變。發現，TRP-4通道蛋白對低強度超聲波敏感性很弱，不能直接被激活，但可以借助微氣泡將低強度的機械信號放大，從而使負壓峰值在0.4～0.6 MPa之間的低強度超聲波可以特異性激活表達TRP-4通道蛋白的神經元。該研究中利用的全氟己烷微泡目前已被廣泛用作體內超聲造影劑[14-16]，可以通過靜脈注射在體內循環并保持1 h左右，為機械敏感性較低的通道蛋白在聲遺傳技術中的應用提供了一個安全而有效的輔助工具。他們還發現，利用超聲波激活特異性表達TRP-4通道蛋白的不同神經元，會導致不同的線蟲個體的行為改變。例如，激活ASH和AWC感覺神經元會增加線蟲的大角度逆轉行為，而激活PVD神經元則會抑制這種行為。這一研究為探索不同的神經元在影響動物個體行為方面的功能提供了一種全新的、非侵入性的方法。而且，TRP-4通道蛋白不具有哺乳動物同源性[17-18]，因此，在哺乳動物大腦中表達這些通道蛋白相對來說是很安全的，有望在哺乳動物中得到進一步應用。

1.1.2 改變細胞膜電位

神經元的激活依賴于細胞膜電位的改變，即動作電位的產生。一些研究針對聲遺傳技術對細胞膜電位的影響進行了探索。Kubanek等[19]研究了聚焦超聲在調節K2P離子通道的K+電流和Nav1.5通道的Na+電流中的作用。發現，頻率為10 MHz、功率為0.3～4.9 W·cm-2的聚焦超聲能夠刺激細胞產生平均約23% 的膜電流升高，證明了聚焦超聲可以成功激活機械敏感離子通道從而改變膜電位。他們還發現，超聲波刺激可以使表達Na+或Ca+機械敏感通道的細胞產生興奮，而對表達K+機械敏感通道的細胞產生抑制。該研究首次在單細胞水平上探究了超聲波對機械敏感離子通道的影響，證明了超聲波可以調節流經特定離子通道的電流，并且這些離子通道在神經元、視網膜、心臟等多種組織中都有表達[20-21]，具有廣闊的研究前景。

Ye等[22]研究了低強度超聲波在刺激哺乳動物細胞產生動作電位中的應用，在原代培養的大鼠海馬體神經元中特異性表達了MscL的功能獲得突變體蛋白MscL I92L，該突變體蛋白對超聲波的響應更敏感，在超聲波的負壓峰值低至0.25 MPa時就可以開啟，并成功觸發細胞產生動作電位。MscL I92L不需要微泡或其它配體的介導，并且其表達對神經元細胞原本的電生理特性和存活情況沒有影響。因此，MscL I92L有潛力發展成為一種通用的調控神經元或其它細胞活動的非侵入性聲遺傳工具。

1.2 在目的基因表達調控中的應用

離子不僅與細胞的膜電位有關，還可以通過激活信號通路來啟動細胞核內基因的轉錄從而調控蛋白的表達。因此，聲遺傳技術可以利用超聲波打開機械敏感離子通道，通過內流的特定離子啟動相應的基因表達，實現對細胞蛋白表達的非侵入性精準調控。Pan等[23]利用低強度超聲波結合微泡打開表達在細胞上的Piezo離子通道，通過孔道內流的Ca2+在細胞質內可以使磷酸酶活化，活化T細胞核因子(NFAT)在磷酸酶的作用下發生去磷酸化反應，隨后轉運至細胞核，在核內與上游轉錄元件相結合，從而啟動下游目的基因的轉錄和后續的蛋白表達。下游目的基因為可編程式，這一策略可以成功調控各種貼壁或懸浮細胞對熒光素酶和GFP等蛋白的表達。在此基礎上，他們設計了嵌合抗原受體(CAR)的Ca2+啟動表達基因，成功利用超聲波調控T細胞中CAR蛋白的表達，并對腫瘤細胞具有識別和清除作用，實現了癌癥免疫治療的精準聲控。這一策略可以利用超聲波對活細胞中的基因表達進行無創的遠程調控，具有高時空精準性，并且通過對目的蛋白基因的設計，可以擴展為對不同類型細胞的不同功能蛋白表達的調控，在癌癥等疾病治療方面有廣闊的應用前景，也為神經科學等其它方向提供了新的思路。

1.3 在腫瘤細胞死亡調控中的應用

以上介紹的聲遺傳技術應用都是基于短時間或脈沖式的超聲波，在機械敏感離子通道短暫性開啟的過程中，其觸發的離子流動對細胞的活性及正常生理活動不會產生影響。而Wen等[24]在最新的研究中針對通道持續性開啟對細胞的影響進行了探索，他們利用MscL的兩種突變體蛋白V23A-MscL和G26C-MscL，V23A-MscL是一種功能獲得型突變體，它的通道能夠在正常生理環境下自發性開啟，而G26C-MscL是一種化學響應型突變體，它會對其化學活化劑MTSET產生響應從而打開通道。他們發現，MscL的持續性開啟會破壞細胞內正常的穩態環境，從而導致細胞胞漿空泡化壞死，并且在小鼠腫瘤模型中具有抑制腫瘤細胞生長的作用，為癌癥治療提供了一種新的策略。目前還沒有將這種細胞死亡誘導策略與超聲波的調控功能相結合的研究應用，這可能是聲遺傳技術極有潛力的后續發展方向。

2 聲遺傳技術面臨的機遇和挑戰

聲遺傳技術的開發和發展為生物學的調控技術提供了全新的策略，但作為一種新興技術，目前其研究和應用范圍仍十分有限，并且存在一些需要解決的問題，主要包括：(1)目前已發現的機械敏感通道蛋白種類很多，但適用于聲遺傳技術的很少，對各類蛋白超聲響應性的研究和對性能更好的突變體蛋白的構建是促進聲遺傳技術發展的重要基礎。(2)目前大部分聲遺傳技術利用的通道蛋白都需要借助微泡等配體提高其對超聲波的敏感性[9，25]，限制了部分方向的應用。(3)需要進一步研究和完善適用于聲遺傳技術的各類型超聲儀器，以配合不同的應用條件和需求。(4)聲遺傳技術的效果很大程度上依賴于細胞對機械敏感通道蛋白的表達效果，目前很多研究利用病毒進行轉染，仍存在一些爭議，因此需要進一步提高蛋白轉染的安全性和表達效率。

聲遺傳技術目前雖然還不夠成熟，但其存在的問題有望通過后續的研究得到完善，并且其應用領域有望得到進一步拓展。總的來說，聲遺傳技術提供了一種通過外界手段非侵入式調控細胞行為及功能的全新策略，為神經科學、免疫學、疾病治療等領域都開拓了新的方向，并且以其非侵入性、精準調控性、高安全性、強穿透性等獨特優勢，有望彌補目前調控手段的不足，并成為未來極有發展前景的重要技術。