阿爾泰金蓮花提取物抑制變異鏈球菌乳酸脫氫酶活性及抗氧化活性研究

姜 敏，田樹革，李柯翱，季志紅*

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011； 2.新疆奇沐醫(yī)藥研究院(有限公司)，新疆 烏魯木齊 830011)

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

阿爾泰金蓮花，采自新疆博樂溫泉，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院李永和主任藥師鑒定為毛茛科、金蓮花屬阿爾泰金蓮花(Trolliusaltaicus)。

牡荊素(批號(hào)20160201)，寶雞辰光生物科技有限公司；葒草苷(批號(hào)H-044-181216)，成都瑞芬思生物科技有限公司；腦心浸出液BHI，北京索萊寶科技有限公司；乳酸脫氫酶試劑盒，南京建成生物工程研究所；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

752型紫外可見分光光度計(jì)，ME204E型電子天平，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，酶標(biāo)儀，潔凈工作臺(tái)，SJ-3F型pH計(jì)，全自動(dòng)式電熱高壓蒸汽滅菌器。

1.2 菌株的培養(yǎng)及菌懸液的制備

將變異鏈球菌菌株(ATCC 76100)從超低溫冰箱中取出，在BHI液體培養(yǎng)基中復(fù)蘇48 h；采用平板劃線法將其接種到BHI瓊脂板上，37 ℃、5%CO2厭氧培養(yǎng)24 h；涂片，顯微鑒定為純培養(yǎng)物。采用取菌環(huán)取單菌落接種于BHI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，用生理鹽水將菌懸液稀釋至106CFU·mL-1。

1.3 阿爾泰金蓮花提取物的制備

稱取阿爾泰金蓮花粗粉10 g，用10倍量30%乙醇回流提取2次，每次1 h，合并濾液，濃縮至浸膏狀后，冷凍干燥，備用。

1.4 最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[11]，采用微量稀釋法測(cè)定MIC。配制50 mg·mL-1的阿爾泰金蓮花提取物溶液，無菌濾頭濾菌后，稀釋至50～3.125 mg·mL-1，依次向96孔板中加入等量不同濃度的阿爾泰金蓮花提取物與菌懸液(106CFU·mL-1)，輕微振蕩混勻，37 ℃、5%CO2孵育24 h，取出觀察；以不加阿爾泰金蓮花提取物為空白對(duì)照組，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)。孔內(nèi)液體清澈透明，沒有細(xì)菌生長(zhǎng)的最小濃度即為MIC。

在MIC測(cè)定的基礎(chǔ)上，選擇96孔板中濃度≥MIC的菌懸液，用取菌環(huán)蘸取菌懸液后在BHI平板上劃線培養(yǎng)24 h，平板上沒有菌落出現(xiàn)的濃度即為MBC。

1.5 生長(zhǎng)曲線的繪制

將106CFU·mL-1菌懸液與含有不同濃度(MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC)阿爾泰金蓮花提取物的BHI液體培養(yǎng)基分別等量加入無菌試管中，37 ℃、5%CO2厭氧培養(yǎng)，分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、14 h、18 h、22 h、26 h、30 h取樣測(cè)定OD600值；以不加藥物為空白對(duì)照組，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)。為避免阿爾泰金蓮花提取物本身顏色的干擾，取不同時(shí)段OD600差值繪制細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線。

1.6 ΔpH值和LDH活性的測(cè)定

按體積比1∶10將菌懸液與含有不同濃度(MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC)阿爾泰金蓮花提取物的BHI溶液混合，測(cè)定上清液的pH值(pH初始)；37 ℃、5%CO2厭氧培養(yǎng)18 h后，3 300 r·min-1離心20 min，測(cè)定上清液的pH值(pH結(jié)束)，并按所提供試劑盒說明測(cè)定LDH活性；以不含藥物的菌懸液為空白對(duì)照組，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)。以ΔpH值(pH初始-pH結(jié)束)評(píng)價(jià)阿爾泰金蓮花提取物對(duì)變異鏈球菌產(chǎn)酸的影響。按式(1)計(jì)算LDH活性(U·L-1)：

×1000

(1)

1.7 抗氧化活性評(píng)價(jià)

1.7.1 DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)

在文獻(xiàn)[12]的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)。配制0.1 mg·mL-1阿爾泰金蓮花提取物溶液，分別稀釋成0.000 3 mg·mL-1、0.000 5 mg·mL-1、0.001 mg·mL-1、0.002 mg·mL-1、0.004 mg·mL-1、0.006 mg·mL-1、0.008 mg·mL-1、0.01 mg·mL-1的樣品溶液。將3 mL樣品溶液與2 mL 1×10-4mol·L-1DPPH自由基溶液在室溫下混合均勻后，避光靜置30 min，以相應(yīng)溶劑為參比測(cè)定520 nm處吸光度；以VC為陽(yáng)性對(duì)照。每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，按式(2)計(jì)算DPPH自由基清除率：

(2)

式中：A0為2 mL DPPH+3 mL無水乙醇的吸光度；A1為2 mL無水乙醇+3 mL樣品溶液的吸光度；A2為2 mL DPPH+3 mL樣品溶液的吸光度。

同法測(cè)定葒草苷和牡荊素對(duì)DPPH自由基的清除率。

1.7.2 ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)

在文獻(xiàn)[13]的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)。將10 mmol·L-1ABTS自由基溶液與10 mmol·L-1K2S2O8溶液混合，過夜靜置16 h，得ABTS儲(chǔ)備液，用無水乙醇稀釋，使其在734 nm處吸光度為0.70±0.02。配制0.4 mg·mL-1阿爾泰金蓮花提取物溶液，分別稀釋成0.05 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1、0.15 mg·mL-1、0.20 mg·mL-1、0.25 mg·mL-1、0.30 mg·mL-1的樣品溶液。將0.2 mL樣品溶液與3.9 mL ABTS自由基溶液在室溫下混合均勻后，避光靜置15 min，以相應(yīng)溶劑為參比測(cè)定吸光度；以VC為陽(yáng)性對(duì)照。每個(gè)樣品平行測(cè)3次，按式(3)計(jì)算ABTS自由基清除率：

(3)

式中：A0為3.9 mL ABTS +0.2 mL無水乙醇的吸光度；A1為3.9 mL無水乙醇+0.2 mL樣品溶液的吸光度；A2為3.9 mL ABTS +0.2 mL樣品溶液的吸光度。

同法測(cè)定葒草苷和牡荊素對(duì)ABTS自由基的清除率。

(4)

式中：A0為用1 mL無水乙醇代替樣品溶液的吸光度；A1為1 mL 10 mmol·L-1HCl溶液代替鄰苯三酚溶液的吸光度；A2為Tris-HCl緩沖液加不同濃度樣品溶液的吸光度。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以x±s表示。首先通過Shapiro-Wilk檢驗(yàn)確認(rèn)數(shù)據(jù)是否服從正態(tài)分布，若方差齊，使用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，P<0.05表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 阿爾泰金蓮花提取物的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度

微量稀釋法測(cè)定結(jié)果顯示，當(dāng)阿爾泰金蓮花提取物濃度≥12.5 mg·mL-1時(shí)，所對(duì)應(yīng)的96孔板內(nèi)的溶液均清澈透明，所以MIC為12.5 mg·mL-1。當(dāng)阿爾泰金蓮花提取物濃度為25 mg·mL-1時(shí)，BHI平板上沒有細(xì)菌生長(zhǎng)，所以MBC為25 mg·mL-1。

2.2 阿爾泰金蓮花提取物的抑菌作用(圖1)

圖1 阿爾泰金蓮花提取物對(duì)變異鏈球菌的抑菌作用Fig.1 Antibacterial effect of Trollius altaicus extract on S.mutans

由圖1可知，在培養(yǎng)的前14 h，藥物組中變異鏈球菌的增殖速度均小于空白對(duì)照組。根據(jù)生長(zhǎng)曲線可知，空白對(duì)照組在培養(yǎng)2 h后就進(jìn)入了對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；14 h后，各濃度阿爾泰金蓮花提取物作用后變異鏈球菌的增殖速度減緩。與空白對(duì)照組相比，阿爾泰金蓮花提取物濃度越大，變異鏈球菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期越晚。

2.3 阿爾泰金蓮花提取物對(duì)變異鏈球菌產(chǎn)酸的影響(表1)

表1 不同濃度阿爾泰金蓮花提取物對(duì)變異鏈球菌產(chǎn)酸的影響

由表1可知，藥物組隨著阿爾泰金蓮花提取物濃度的增大，ΔpH值從0.49±0.03下降到0.09±0.03。各濃度藥物組培養(yǎng)液的ΔpH值均低于空白對(duì)照組的ΔpH值，具有顯著性差異(P<0.05)。

2.4 阿爾泰金蓮花提取物對(duì)變異鏈球菌LDH活性的影響(圖2)

由圖2可知，與空白對(duì)照組相比，各濃度阿爾泰金蓮花提取物作用于變異鏈球菌后，LDH活性均顯著降低(P<0.05)；且隨著藥物濃度的增大，LDH活性呈下降趨勢(shì)，表明阿爾泰金蓮花提取物抑制LDH活性能力逐漸增強(qiáng)。

圖2 阿爾泰金蓮花提取物對(duì)變異鏈球菌乳酸脫 氫酶活性的影響Fig.2 Effect of Trollius altaicus extract on LDH activity of S.mutans

2.5 阿爾泰金蓮花提取物的抗氧化活性

2.5.1 阿爾泰金蓮花提取物對(duì)DPPH自由基的清除作用(圖3)

圖3 阿爾泰金蓮花提取物對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.3 Scavenging effect of Trollius altaicus extract on DPPH free radicals

由圖3可知，除牡荊素外，阿爾泰金蓮花提取物、葒草苷、VC在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)DPPH自由基的清除作用具有一定的量效關(guān)系。當(dāng)濃度低于0.008 mg·mL-1時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率大小依次為VC>葒草苷>阿爾泰金蓮花提取物>牡荊素。

2.5.2 阿爾泰金蓮花提取物對(duì)ABTS自由基的清除作用(圖4)

由圖4可知，隨著濃度的增大，牡荊素與阿爾泰金蓮花提取物對(duì)ABTS自由基的清除率逐漸升高，但量效關(guān)系不明顯；VC與葒草苷對(duì)ABTS自由基的清除率逐漸升高，且具有一定的量效關(guān)系。當(dāng)VC與紅草苷基本將ABTS自由基清除完全時(shí)，阿爾泰金蓮花提取物對(duì)ABTS自由基的清除率為49.48%，牡荊素僅為10.41%。在一定濃度范圍內(nèi)，對(duì)ABTS自由基的清除率大小依次為VC>葒草苷>阿爾泰金蓮花提取物>牡荊素；當(dāng)濃度超過0.15 mg·mL-1后，VC與葒草苷對(duì)ABTS自由基的清除率基本保持不變，說明這2種藥物對(duì)ABTS自由基的清除作用已經(jīng)達(dá)到飽和，且葒草苷對(duì)ABTS自由基的清除作用與VC基本相當(dāng)。

圖4 阿爾泰金蓮花提取物對(duì)ABTS自由基的清除作用Fig.4 Scavenging effect of Trollius altaicus extract on ABTS free radicals

圖5 阿爾泰金蓮花提取物對(duì)的清除作用Fig.5 Scavenging effect of Trollius altaicus extract on

2.6 討論

齲齒是一種常見的慢性細(xì)菌感染性口腔疾病，糖攝入量以及口腔衛(wèi)生習(xí)慣、口腔菌群的改變都是導(dǎo)致齲齒產(chǎn)生的關(guān)鍵原因。現(xiàn)廣泛采用抗生素和氟化物治療，雖然具有一定的治療效果，但是在使用過程中出現(xiàn)的耐藥性以及抗生素濫用等現(xiàn)象也引起人們的廣泛關(guān)注。近年來，研究者更加關(guān)注天然產(chǎn)物在口腔疾病方面的應(yīng)用。

變異鏈球菌可以在牙釉質(zhì)表面形成菌斑生物膜從而可以不受外界環(huán)境干擾定植在口腔中[15]，形成的生物膜成為隔絕變異鏈球菌與外界環(huán)境的有利屏障，使膜內(nèi)的細(xì)菌生長(zhǎng)在厭氧和酸性的環(huán)境中[16]，從而給齲齒的發(fā)生提供了有利的環(huán)境條件。因此，抑制變異鏈球菌的生長(zhǎng)和降低LDH活性是治療口腔疾病的關(guān)鍵。對(duì)口腔致齲菌的研究需要從藥物對(duì)變異鏈球菌的生長(zhǎng)、酸代謝、LDH活性的影響以及清除自由基等多方面進(jìn)行。

本研究通過微量稀釋法測(cè)定了阿爾泰金蓮花提取物對(duì)變異鏈球菌的MIC與MBC值，測(cè)得MIC值為12.5 mg·mL-1，MBC值為25 mg·mL-1。通過繪制變異鏈球菌的生長(zhǎng)曲線，可以直觀地反映阿爾泰金蓮花提取物濃度對(duì)其生長(zhǎng)水平的影響。結(jié)果表明，在本實(shí)驗(yàn)設(shè)定的濃度范圍內(nèi)，阿爾泰金蓮花提取物的濃度越大，對(duì)變異鏈球菌生長(zhǎng)的抑制作用越強(qiáng)。

變異鏈球菌的產(chǎn)酸能力與致齲能力具有相關(guān)性。產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著阿爾泰金蓮花提取物濃度的增大，ΔpH值逐漸減小，抑制產(chǎn)酸作用逐漸增強(qiáng)。綜上，阿爾泰金蓮花提取物不僅能有效抑制變異鏈球菌的生長(zhǎng)，還能抑制其產(chǎn)酸。

研究發(fā)現(xiàn)，變異鏈球菌的產(chǎn)酸能力除受其它信使分子的調(diào)控外[17]，LDH也是其產(chǎn)酸過程中的重要因子。LDH在菌體內(nèi)部和外部均有分布，可以通過菌懸液測(cè)定其活性[18]。以1/8MIC～MIC濃度的阿爾泰金蓮花提取液作用于變異鏈球菌后，藥物組菌懸液的LDH活性較空白對(duì)照組明顯下降(P<0.05)。可初步推斷，阿爾泰金蓮花提取物抑制變異鏈球菌的作用途徑為：通過抑制LDH活性，影響丙酮酸向乳酸的轉(zhuǎn)化，從而抑制變異鏈球菌產(chǎn)酸，降低培養(yǎng)液pH值。

3 結(jié)論