胰液中循環游離DNA甲基化異常在胰腺癌早期診斷中的應用

周 艷，寧 波

重慶醫科大學附屬第二醫院 消化內科，重慶 400000

胰腺癌是世界上最致命的癌癥之一，是中國第六大癌癥相關死亡原因[1]和全球第七大癌癥相關死亡原因[2]，其5年生存率不超過5%[3]。由于胰腺其位于腹膜后深層的特殊解剖位置，且毗鄰十二指腸和膽總管，以及其臨床癥狀的非特異性，使得患者確診時往往已經錯過了最佳治療時期。只有少數患者在診斷時可以進行根治性切除[4]，且術后根治性切除率不足20%[5]。早期診斷胰腺癌是改善其預后的最佳和目前唯一的選擇[4]。目前臨床應用最廣泛的血清腫瘤標志物(CA19-9、CEA)特異度較低，在急性胰腺炎、急性肝炎、肝硬化、胃癌等疾病中也可能出現升高。診斷胰腺癌的影像學手段主要有CT、MRCP及MRI，內鏡手段如經內鏡逆行胰膽管造影(ERCP)和內鏡超聲(EUS)。但胰腺存在諸多占位性質的病變，除了胰腺癌以外，還有胰腺炎性實性占位、異位組織及囊性及囊實性占位等，使用影像學手段要做到準確地判斷胰腺占位性質往往非常困難。盡管近幾年超聲內鏡引導下細針穿刺活檢(EUS-FNA)為部分患者解決了這一診斷難題[6]，但這是一種侵襲性操作，有時由于病灶周圍主要血管的原因，解剖學上難以接近胰腺腫塊。另外在EUS-FNA的操作過程中還存在癌細胞播散風險。為了改善預后，迫切需要尋找一種臨床應用方便的、微創的和對早期診斷有較大價值的胰腺癌診斷方法。

1 DNA甲基化與胰腺癌

目前許多研究已經證明異常的DNA甲基化是多種腫瘤發生的早期事件，不同種類的腫瘤顯示一個或多個基因的異常甲基化(表1)[5]。研究者們針對胰腺癌的DNA異常甲基化也做了大量的研究，還深入探討了它們在胰腺癌早期診斷中的效用。Yi等[7]發現了ADAMTS1與BNC1基因在胰腺癌細胞中的異常甲基化，還發現BNC1甲基化陽性率隨著胰腺上皮內瘤變(pancreatic intraepithelial neoplasia，PanIN)的等級增加而增加。同時Sato與Fukushima等[8-10]的多項研究顯示以CDH3為首的9個基因甲基化陽性率也有這一現象，在胰腺癌細胞中這些基因的異常甲基化更為頻繁，其中UCHL甲基化陽性率達100%。Ginestà等[11]有試驗證明HRH2、EN1、SPARC、CDH13、APC中兩個或多個啟動子高甲基化對胰腺癌有診斷意義。楊衛華等[12]研究表明p16基因啟動子區甲基化異常水平與胰腺癌組織分化程度、有無轉移、PTMN分期有關。Parsi 等[13]通過定量甲基化特異性聚合酶鏈反應(quantitative methylation specific PCR,QMSP)檢測了膽道或/和胰管狹窄患者的內窺鏡刷取樣本，發現NPTX2、TFPI-2、cyclin D2基因的甲基化狀態可以鑒別胰腺癌、其他壺腹部周圍癌、良性壺腹周圍疾病。Park等[14]也指出胰腺癌細胞學樣本的NPTX2甲基化檢測比病理學檢測敏感度更好。除基因異常高甲基化之外，異常低甲基化也可通過上調癌基因的表達參與腫瘤的發生發展。Yokoyama等[15]的研究結果顯示胰腺導管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)中MUC1 和 MUC4 的啟動子區域存在DNA 異常低甲基化。還有研究[16-18]發現MUC4啟動子的低甲基化在PDAC和PanIN-H細胞中的頻率顯著高于PanIN-L和正常胰腺細胞。Sato等[19]在5種胰腺癌細胞株中也發現MMP-2、MMP-7和MMP-9基因呈低甲基化狀態。這些研究提供了PanIN-PDAC進展模型中多種基因異常甲基化頻率增加的證據，同時癌癥基因組圖譜和國際癌癥基因組聯盟已經為包括胰腺癌在內的25種癌癥類型的數千個腫瘤樣本生成了甲基化基因組數據[20-22]。DNA甲基化檢測不僅有助于胰腺癌的早期診斷，或許還能在胰腺癌的一級預防中發揮一定的作用。因此，需要選取一種易獲取、準確性高的標本用于DNA甲基化檢測，包含循環游離DNA(cell free DNA，cfDNA)、循環腫瘤細胞(circulating tumor cell, CTC)在內的液體活檢技術作為一種新興技術為研究者們提供了新思路。

表1 人類癌癥中常見的甲基化基因及其在腫瘤發展中的作用

2 cfDNA甲基化與胰腺癌

cfDNA最初是指游離于細胞外的DNA片段，存在于血漿、血清以及其他體液中，長度100～300 bp，它可以是正常組織細胞釋放的DNA片段，也可以是腫瘤細胞或者其轉移灶釋放出的含有腫瘤異常DNA信息的片段，因此也被稱為循環腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)。正常人體循環中含的cfDNA非常低，超過90%的人每毫升血漿中不超過25 ng，而腫瘤患者可以達到數倍。尤為重要的是，ctDNA中包含有大量與腫瘤有關的信息，如癌基因的突變，與腫瘤發生有關的細胞信號通路的異常和遺傳表觀修飾的異常等。因此，通過檢測ctDNA與CTC，能夠早期、高敏感、高特異診斷腫瘤并提供精準醫療的信息，它們一起被稱為腫瘤的液體活檢技術。

有很多學者都探索了cfDNA甲基化異常對胰腺癌診斷的價值，初步的結果是令人振奮的。Kisiel等[23]利用檢測糞便中DNA的甲基化異常標志來診斷胰腺癌。Thompson等[24]通過分析胰腺癌患者的甲基化異常特征發現，胰腺癌組織甲基化異常與患者生存率密切相關。Kisiel等[25]甚至還通過甲基化特異性PCR的辦法對胰液中的CD1D、KCNK12、CLEC11A、NDRG4、IKZF1、PKRCB, 以及KRAS等多個胰腺癌相關的標志物位點甲基化做了檢測，結果發現以CD1D為首的標志物甲基化異常對胰腺癌診斷有特別的價值。Yi等[7]針對胰腺癌患者的血清標本進行了分析，結果顯示BNC1、ADAMTS1兩種基因一起用于胰腺癌早期診斷時的敏感度和特異度達81%、85%。Neale等[26]利用 Methy Light QMSP的方法通過研究白細胞中LINE-1、Alu and Sat2 DNA重復原件結果，發現其過度甲基化可用于診斷胰腺癌，且其中LINE-1與胰腺癌危險度密切相關。因此，cfDNA及其甲基化異常的檢測能夠成為一種非常有潛力的診斷手段。

3 胰液cfDNA甲基化與胰腺癌

目前發表的文獻中選取的標本有血漿、白細胞、糞便、胰液以及腫瘤組織等。從標本的獲得性來講，糞便和血液最易獲得，而腫瘤組織最為困難。從準確性和最能反映腫瘤細胞的特征性角度講，腫瘤組織最佳，胰液次之，而血液和糞便更易受其他組織器官的干擾。因此。作者認為選取相對容易獲得且直接來源于胰腺的胰液最為合適。Ginesta等[27]對85例胰腺癌、26例壺腹癌、10例胰腺導管內乳頭狀黏液腫瘤(intraductal papillary mucinous neoplasm，IPMN)、14例慢性胰腺炎患者的135份胰液進行了甲基化特異性熔解曲線分析，發現APC甲基化作為一個單獨的檢測標志來識別胰腺癌有很好的性能，其敏感度達71%，特異度達93%。在考慮所有腫瘤時，APC敏感度仍然很高(73%)。還有研究[28]指出檢測胰液樣本中MUC1、MUC2和MUC4啟動子的DNA甲基化水平可以區分胃型IPMN、腸型IPMN、其他型IPMN和PDAC。重要的是，在小胰腺癌(直徑<2 cm)患者的胰液樣本中也檢測到異常甲基化的DNA[10]。Matsubayashi等[29-30]與Yao等[31]的研究也表明了胰液的DNA甲基化檢測對胰腺癌、IPMN、慢性胰腺炎有良好的鑒別能力。兩項試驗都進一步通過QMSP對基因的甲基化進行了量化分析，發現檢測的敏感度比正常MSP更好。Nishizawa等[32]對比了胰液、常規活檢樣本與EUS-FNA細胞學樣本的CDO1啟動子甲基化情況，結果發現胰液檢測胰腺癌的靈敏度達95%，明顯高于常規活檢樣本(33%)和EUS-FNA細胞學樣本(88%)。上述從胰液中提取cfDNA的研究中發現諸多異常甲基化的基因，并且對于診斷胰腺癌的敏感度、特異度尚佳。而獲取胰液的方式多種，Sato 等[9]的研究是直接從橫切的胰管中抽吸的胰液，Kisiel等[25]則是對患者靜脈注射促胰液素16 mg后通過十二指腸腔抽吸術收集的胰液，也有研究[29-30]是通過ERCP回收的胰液。現在內鏡技術非常發達，通過ERCP獲得胰液標本相對微創、準確，若留置鼻胰引流管(如果患者合并膽胰管梗阻)，還可以多次獲得標本用于評價治療效果和隨訪等。

4 總結

胰腺癌是消化系統常見的惡性腫瘤，其早期缺乏特異性癥狀，以及腫瘤的高生物攻擊性和抗細胞毒性藥物，都導致了胰腺癌的高致死率。為了改善胰腺癌的預后，人們對早期診斷的需求越來越高，因此迫切需要尋找一種早期診斷的新途徑。對胰腺癌的分子流行病學的研究[33]表明，從癌前病變到癌癥，從早期癌癥到晚期癌癥的進展速度較慢。這一間隔時間為發現癌前病變和早期的胰腺癌提供了機會。目前已在胰腺癌患者的胰液樣本中發現多種異常甲基化的基因，在其癌前病變中也有類似發現，例如PanIN患者、IPMN患者，這些基因無論是單獨的還是組合的，都有研究支持其作為胰腺癌早期診斷的潛在生物標志物。但是其中一部分基因的異常甲基化在其他腫瘤中也有被檢測到。另外，正常組織中也存在低水平的DNA甲基化，并且對于某些基因，其陽性頻率會隨著年齡的增長而升高[30]。因此，仍需要大量的研究及實驗來推動胰液中cfDNA甲基化檢測在胰腺癌早期診斷中的應用。

作者貢獻聲明：周艷負責課題設計，收集并分析資料，撰寫及修改論文；寧波負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。