肝硬化合并門靜脈血栓患者外周血血管內皮生長因子的檢測及意義

姚運海，羅 艷，朱京樂，甘建和，趙衛峰

1 蘇州大學附屬第一醫院 感染科/肝病ICU，江蘇 蘇州 215006； 2 湖南省婦幼保健院 醫務部，長沙 410007

門靜脈高壓及其并發癥是失代償期肝硬化的主要臨床表現，門靜脈血栓(portal vein thrombosis，PVT)也是門靜脈高壓的常見并發癥，發生率為10%～25%[1]。肝硬化患者PVT形成的臨床表現從無癥狀期到危及生命表現不一，多在隨訪期間行影像學檢查發現，其發生機制復雜，但并不認為低凝狀態是其高發的高危因素，目前肝硬化PVT形成的診斷與治療管理尚未有共識。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是一種內皮細胞特異性有絲分裂原，在肝硬化組織中高表達[2]，誘導微血管生成，其水平高低與PVT發生相關[3]。本文為求探索一種簡便、無創的檢測指標，便于早期準確診斷PVT發生情況。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2017年1月-2019年12月在蘇州大學附屬第一醫院門診隨訪或者住院的肝硬化合并PVT患者60例(PVT組)，同期肝硬化合并門靜脈高壓無血栓形成者161例(LC組)。所有入組患者均需符合2019年中華醫學會制定的《肝硬化診治指南》[4]，PVT組需彩色多普勒、CT、MR或者血管造影等檢查首次發現明確診斷。入組221例肝硬化患者中有36例患者因食管胃底靜脈曲張破裂出血行經頸靜脈肝內門體分流術(transjugular intrahepatic portosystem stent-shunt,TIPS)治療，術中測量肝靜脈壓力梯度(hepatic venous pressure gradient，HVPG)。排除血液系統疾病、惡性腫瘤癌栓、腹腔感染、布加綜合征等可能導致的PVT。

1.2 觀察指標 收集患者入院時的臨床資料，包括性別、年齡、WBC、PLT、TBil、ALT、Alb、PT、INR、AT-Ⅲ水平等，根據實測值進行Child-Pugh分級。

1.3 雙抗體夾心原理酶聯免疫吸附法檢測血清VEGF水平 在微孔板中預包被VEGF單克隆抗體等，再加入酶標抗體工作液(辣根過氧化物標記的VEGF單克隆抗體)和顯色劑TMB，通過酶標儀檢測吸光度(A值)從而判斷樣品中VEGF水平。

1.4 倫理學審查 本研究經由蘇州大學附屬第一醫院倫理委員會批準(審批號：156號)，所有患者家屬簽署過知情同意書。

2 結果

2.1 一般資料 PVT組與LC組患者基線指標比較，血清VEGF水平有明顯差異(P<0.05)，其他指標差異均無統計學意義(P值均>0.05)(表1)。

2.2 2組患者血清VEGF水平在不同Child-Pugh分級中比較 結果顯示，不論是Child-Pugh A級還是Child-Pugh B、C級，PVT組與LC組患者血清VEGF水平比較，差異均有統計學意義(P值均<0.05)(圖1)。

表1 PVT組與LC組患者一般資料比較

2.3 血清VEGF水平與HVPG的相關性 36例肝硬化合并食管胃底靜脈曲張破裂出血患者的HVPG檢測值為(24.444±5.578)mm Hg。相關性分析顯示，VEGF水平與HVPG呈正相關(r=0.593，P<0.001)(圖2)。

2.4 logistic回歸分析肝硬化合并PVT的危險因素 單因素分析顯示，性別和VEGF是肝硬化合并PVT的影響因素(P值均<0.05)(表2)。將單因素分析中有統計學意義的變量進行二分類logistic回歸分析，結果顯示只有VEGF水平為肝硬化合并PVT的獨立危險因素(OR=1.004, 95%CI: 1.003～1.006,P=0.013)。

3 討論

門靜脈高壓和側支循環形成是失代償期肝硬化的特點，PVT形成是晚期肝硬化的常見并發癥[5]，血管生成與肝內外因素均有關，在肝臟內，血管生成促進肝纖維化，從而促進門靜脈高壓，在肝臟外，與側支循環形成也有相關性[3]。VEGF又稱血管通透因子，是一種高度特異性的促血管內皮細胞生長因子，具有促進血管通透性增加、細胞外基質變性、血管內皮細胞遷移、增殖和血管形成等作用[6]。研究[7]顯示，VEGF水平升高與慢性肝病及肝細胞癌之間有密切關系。

本研究顯示，PVT組與LC組相比，外周血VEGF水平明顯升高(P<0.001)，且在Child-Pugh A級、Child-Pugh B及C級中，PVT組均較LC組有明顯差異(P值均<0.05)。既往在肝硬化患者中的研究顯示，其外周血VEGF高于健康人群，而VEGF增加可能與其并發癥發生有關[8]，可能的解釋是慢性肝病的慢性炎癥刺激肝星狀細胞和竇狀內皮細胞局部釋放血管生成因子[9]。在本研究中，有36例患者因食管胃底靜脈曲張破裂出血行TIPS治療，進一步研究顯示血清VEGF水平與HVPG呈正相關。這也與既往研究[10]結果相似，因HVPG與肝硬化分期、在并發癥發生發展等過程中都存在重要意義。肝硬化患者外周血VEGF水平明顯升高[11-12]，推測可能的機制為：(1)門靜脈高壓者肝細胞處于缺氧狀態[13]，使得Nrf2/HO-1表達增加，激活相關信號通路，從而達到血管生成標志物(包括VEGF)表達增加[14]；(2)在肝硬化發展過程中，Neuropilin-1通過血管內皮生長因子受體2依賴的PI3K/Akt途徑促進肝竇內皮細胞血管生成而加重肝硬化，同時表達更高的VEGF[15-16]。

VEGF選擇性誘導細胞增殖[17]，引起血管滲透性增強，導致血管滲透、水腫及炎癥加重，引起內皮細胞增生[18]，與肝硬化分期有關[19]。本研究顯示，VEGF可作為肝硬化合并PVT的危險預測因子，提示VEGF在肝硬化合并PVT中起到一定的作用，這也與既往相關研究[8]一致。PVT形成的機制可從經典的Virchow理論理解：(1)血管內皮損傷，肝硬化患者肝臟假小葉形成以及纖維壓迫小葉下靜脈、中央靜脈、肝竇使門靜脈回流受阻，導致內皮細胞缺血損傷，另外隨著門靜脈高壓形成，此外血流剪切力增高也可損傷血管內皮細胞，暴露內皮下膠原，啟動凝血途徑，另外包括TIPS、脾切除術、胃鏡下治療、感染等均有使肝臟血管內皮暴露的風險[20]，以致缺血或者受損的肝細胞釋放VEGF；(2)肝硬化形成后，假小葉形成，門靜脈血流速度減慢或者受阻，門靜脈壓力發生改變[21-22]，研究[23]顯示門靜脈血流速度是PVT形成的獨立危險因素；(3)凝血與抗凝機制紊亂，任何因素引起兩者脆弱的平衡狀態發生改變均有誘發出血或者形成血栓的風險[21]，既往多項研究[24-25]結果可予以證實。

表2 肝硬化合并PVT危險因素的單因素logistic回歸分析

總之，肝纖維化伴隨肝臟血管再生，血栓形成導致血管壁受損，誘發血管通透性增加，加重肝細胞缺血缺氧性改變，引起內皮細胞增生，釋放VEGF，表現為外周血VEGF表達增多。故而當肝硬化患者發生門靜脈血栓時患者外周血VEGF可更高的表達，對臨床診斷有指導作用。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻聲明：姚運海、羅艷、朱京樂等負責提出研究選題、設計研究方案、實施研究過程、采集整理數據；姚運海等負責調研整理文獻、設計論文框架、起草論文、修訂論文、終審論文；甘建和、趙衛峰等負責統計分析、獲取研究經費、技術或材料支持、指導性支持。