重金屬Cu2+對棘腹蛙蝌蚪的急性毒性研究

張小琴 覃仙鳳

摘要?為研究重金屬Cu2+對棘腹蛙蝌蚪的急性毒性效應，通過單一變量急性毒性試驗研究其在室內條件（溫度16～20 ℃、濕度885%左右）對棘腹蛙蝌蚪的毒性效應。結果表明：根據寇氏法原理，得到Cu2+對2月齡棘腹蛙蝌蚪在24、48、72、96 h時的半致死濃度（LC50）分別為1.160、1.136、1.191和0.870 mg/L。依據安全濃度計算公式，計算出安全濃度為0.087 mg/L。根據毒性評價標準，比較了Cu2+對不同種類蝌蚪的毒性程度，發現棘腹蛙蝌蚪的耐受性較弱。該研究可為水環境監測以及其他相關重金屬離子的毒性研究提供參考，為更好地保護棘腹蛙蝌蚪提供基礎數據材料。

關鍵詞?Cu2+;棘腹蛙蝌蚪;急性毒性;毒性評價;半致死濃度（LC50）

中圖分類號?S?917.4文獻標識碼?A文章編號?0517-6611（2020）17-0115-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.17.029

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Study on the Acute Toxicity of Copper Ions to Tadpoles of Quasipaa boulengeri

ZHANG Xiao?qin， QIN Xian?feng

（College of Resources and Environment， Aba Teachers University， Wenchuan，Sichuan623002）

Abstract?In order to study the acute toxic effects of heavy metal Cu2+ on the tadpoles of Quasipaa boulengeri， a single?variable acute toxicity test was conducted to study the toxic effects of indoor conditions （temperature 16-20 ℃， humidity 88.5%） on the tadpoles. The results showed that the semi?lethal concentration （LC50） of heavy metal Cu2+ at 24， 48， 72 and 96 h were 1.160， 1.136， 1.191， 0.870 mg/L， respectively. According to the safe concentration calculation formula， the safe concentration was calculated to be 0.087 mg/L. According to the toxicity evaluation criteria， the toxicity degree of Cu2+ to different species of tadpoles was compared， and the tadpoles of Q.boulengeri were weakly tolerated. This study can provide references for water environment monitoring and other related heavy metal ion toxicity studies， and provide basic data materials for better protection of Q. boulengeri.

Key words?Cu2+;Tadpoles of Quasipaa boulengeri;Acute toxicity;Toxicity evaluation;Semi?lethal concentration （LC50）

由于汶川地質災害及洪澇災害引發化工原料泄露、環保設施破壞等環境問題，使得土壤水域中富含重金屬，如Cu2+、Hg2+、Ag+等[1]。當水環境中的重金屬含量超過蝌蚪的耐受程度，會對生活在汶川的兩棲類動物特別是棘腹蛙蝌蚪有一定影響。棘腹蛙俗名石蛙、石雞、梆梆魚等，棘腹蛙在食用、藥用、科研、生態環境等方面的價值極高，但最近幾年人為因素及環境因素導致棘腹蛙個體數量大幅度減少，1920年確定棘腹蛙（Quasipaa boulengeri）亦稱棘胸蛙（Quasipaa tibetanus），屬于同物異名。棘腹蛙已經先后被列入《中國瀕危物種紅皮書》和《中國物種紅色名錄》。棘腹蛙蝌蚪皮膚滲透性強，對外界環境的毒性影響異常敏感，在這一階段試驗的最大致毒濃度與外界環境頗為相似。國內外有關重金屬對棘腹蛙蝌蚪的毒理研究較少，國內有學者研究了棘胸蛙在氨氮脅迫條件下毒理試驗[2]，也有學者研究了重金屬Cu2+脅迫對棘腹蛙存活、行為和體重增長的影響[3]，但缺少Cu2+對棘腹蛙蝌蚪的急性毒性研究。其中水環境中的Cu2+易致早期的棘腹蛙蝌蚪大量死亡，從而造成棘腹蛙個體的成活率大幅度降低。筆者探究了重金屬Cu2+對棘腹蛙蝌蚪的急性毒性影響，旨在為水環境檢測以及其他相關重金屬離子對棘腹蛙蝌蚪的毒性研究提供參考，以更好地保護棘腹蛙蝌蚪。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?試驗試劑。

硫酸銅（CuSO4）、冰乙酸（CH3COOH）。

1.1.2?試驗器材。

透明方箱（28.0 cm×19.5 cm×16.5 cm）、燒杯、電子天平、pH試紙、游標卡尺、溫度計、小米米家智能攝像機等，均由阿壩師范學院資源與環境學院實驗室提供。

1.1.3?試驗動物及分組。

棘腹蛙蝌蚪購自雅安市林溪地棘胸蛙養殖專業合作社，隨機選擇大小均勻、食欲強、活動能力強的2月齡棘腹蛙蝌蚪500尾（平均體長3.97 cm，平均體重0.41 g），分為試驗組和對照組。

1.1.4?水處理。

飼養蝌蚪用水為阿壩師范學院后山小溪取得，將溪水通風靜置2 d后使用，以沉淀泥沙，避免對棘腹蛙蝌蚪的試驗結果造成影響。

1.2?試驗方法

1.2.1?試驗溶液的配制。

準確稱量CuSO4 0.1 g，將其溶于100 mL水中，再加入適量的冰乙酸，抑制Cu2+的水解，配制成質量濃度為1.0 mg/L的母液，備用。

1.2.2?蝌蚪的飼養。

投放熟飼料、熟白菜交替喂養，每隔24 h換1次水以及喂食。

1.2.3?預試驗。

參考相關文獻[3]，在較大范圍內對少量蝌蚪進行試驗。各試驗組試驗溶液濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、3.0、4.0 mg/L，同時設置空白對照組（試驗溶液濃度為0 mg/L），每個濃度梯度下設置1 個平行對照組。在每個容器中加入1 L處理后的水，分別加入不同濃度梯度的硫酸銅溶液，每個容器中放入10尾蝌蚪。試驗溶液pH為7，水溫為17.3～20.5 ℃，室內溫度為16～20 ℃，濕度為75.9%，每隔24 h換試驗溶液1次，并喂食。試驗開始時安裝攝像機，觀察蝌蚪的中毒癥狀，并分別記錄4、12、24、48、72、96 h時蝌蚪死亡數量。根據預試驗結果，得出試驗的最小致死濃度和最大安全濃度，從而確定正式試驗的濃度范圍。

1.2.4?正式試驗。

根據預試驗結果，按等差質量濃度梯度設置各試驗組試驗溶液濃度分別為0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2 mg/L。每個濃度梯度均設置3個平行組，同時設置了3個空白對照組（試驗溶液濃度為0 mg/L），貼好標簽紙。在每個容器中加入1 L水，用吸量管取適量的配制好的母液滴入對應容器中。隨機選取蝌蚪10尾，放養于容器中。測量并記錄水溫、pH、室內溫度和濕度等。采用靜止試驗法[4]，試驗開始后觀察蝌蚪的中毒情況，前4 h進行連續觀察，并及時撈出死亡個體，以免污染水質（死亡標準以用玻璃棒觸動蝌蚪時，其身體無反應），隨后觀察并記錄12、24、48、72、96 h時的死亡數量。試驗期間注重觀察蝌蚪的平衡、游動及體色狀態。

1.2.5?數據統計與分析。

半致死濃度（LC50）采用寇氏法原理來計算;安全濃度（SC）采用公式SC=96 h LC50×0.1來計算;最后，對試驗數據進行統計分析。

2?結果與分析

2.1?預試驗

根據預試驗結果得知，試驗溶液pH為7.0，水溫為17.3～20.5 ℃，室內溫度為18～20 ℃，濕度為75.9%。在24 h內濃度分別為3和4 mg/L的試驗組蝌蚪全部死亡，在96 h內濃度為2 mg/L的蝌蚪全部死亡。根據以上結果，確定最小致死濃度為2 mg/L，最大安全濃度為1 mg/L。因此，確定正式試驗的濃度梯度為0.8～2.2 mg/L。在前4 h內，濃度0.1～1.0 mg/L的試驗組蝌蚪無明顯中毒癥狀，而濃度2～4 mg/L試驗組蝌蚪表現出明顯的中毒癥狀（明顯出現頭暈，身體擺動劇烈，不定向運動，在水中側翻后又恢復正常，懸浮在水中，連續以往動作，不久后身體失衡側翻或仰臥在水中）。

2.2?正式試驗

2.2.1?中毒癥狀。

在試驗溶液pH 7.0，水溫18.4～19.2 ℃，室內溫度16～20 ℃，濕度88.5%的條件下，Cu2+對蝌蚪的中毒癥狀結果如圖1～3所示。

使用攝像設施連續觀察蝌蚪的行為變化。從圖1～3可以看出，中毒前，蝌蚪的體色正常，活躍能力強;中毒后，蝌蚪運動強烈，尾末端擺動明顯，上下翻騰，體表有分泌物，體色變淡，試液混濁，不久后身體徹底失衡，仰臥于水中，死亡的蝌蚪體表變灰，尾鰭透明，皮膚出現潰爛。

2.2.2?Cu2+對棘腹蛙蝌蚪的急性毒性影響。

在96 h內不同質量濃度的Cu2+處理后累計2月齡棘腹蛙蝌蚪死亡數及其急性試驗結果如表1、2所示。

由表1可知，隨著Cu2+濃度的增加及時間的延長，棘腹蛙蝌蚪數量死亡數增多。由于蝌蚪的體表滲透能力強，Cu2+濃度越大，對蝌蚪的刺激性越強，毒性越強;較小的個體先死亡。大多數水產養殖中常用0.7 mg/L CuSO4溶液（含Cu2+0.178 mg/L）噴灑全池，為防治原生動物疾病以及藻類生長而危及多數兩棲動物的生長[4]。由于棘腹蛙的LC50低于0178 mg/L，耐毒性極弱，對于棘腹蛙蝌蚪的傷害較大，表明此種噴灑方式對于2月齡棘腹蛙蝌蚪的疾病預防是不可行的。

由表2可知，隨著Cu2+濃度的增加，在96 h內的累計2月齡棘腹蛙蝌蚪死亡數及死亡率逐漸增大，在2.0和2.2 mg/L濃度條件下累計死亡數及死亡率均達到最大值，蝌蚪全部死亡。

根據表1試驗結果，再通過回歸分析得出Cu2+對蝌蚪的急性毒性試驗結果（表3）。在24、48、72、96 h Cu2+的LC50分別為1.160、1.136、1.191和0.870 mg/L。依據SC計算公式，計算出SC為0.087 mg/L。根據《水生生物監測手冊》中對魚類（蝌蚪）毒性評價標準及我國化學物質毒性分級標準（96 h LC50 <1.0 mg/L 時為急性毒性Ⅰ級，1.0 mg/L ≤96 h LC50 <10.0 mg/L 為急性毒性Ⅱ級，10.0 mg/L≤96 h LC50 ≤ 100.0 mg/L 為急性毒性Ⅲ級），可判定Cu2+對棘腹蛙蝌蚪的急性毒性等級為Ⅱ級;根據《水生生物監測手冊》中農藥對魚類（蝌蚪）的毒性等級劃分標準（劇毒，96 h LC50<1.0 mg/L;高毒，1.0 mg/L ≤96 h LC50 <100.0 mg/L;中低毒，100.0 mg/L≤96 h LC50 <1 000.0 mg/L;低毒，1 000.0 mg/L≤96 h LC50 ≤10 000.0 mg/L ;微毒或無毒，96 h LC50 >10 000.0 mg/L），判定2月齡棘腹蛙蝌蚪對Cu2+的毒性等級為劇毒。在整個試驗過程中，對照組中的蝌蚪正常游動，未出現任何中毒癥狀，無死亡個體;其他試驗組均出現不同程度的中毒狀況及死亡狀態。

3?結論與討論

由Cu2+對2月齡棘腹蛙蝌蚪的毒性試驗結果可知，在同一質量濃度下，隨著時間的延長，蝌蚪的死亡數增加，死亡率逐漸升高;在相同時間內，Cu2+的質量濃度越大，蝌蚪的死亡數越多，死亡率越大，并且當質量濃度達到一定濃度時，死亡速率極快;個體小的蝌蚪比個體大的蝌蚪先死亡。棘腹蛙蝌蚪對于Cu2+的耐受性極弱，2月齡棘腹蛙蝌蚪對Cu2+的毒性等級為劇毒。重金屬急性毒性試驗對蝌蚪的行為形態、生長發育、機體酶活性、組織器官、遺傳等方面均有極大影響，從而使蝌蚪中毒。其中對蝌蚪的行為形態的影響最為明顯，主要表現在以下方面：游動能力遲緩，游動方向不確定;側翻或仰臥在水中，體色泛白，體呈僵直在水中;游動能力遲緩;游動方向不定向;皮膚潰爛，試驗溶液混濁。Cu2+對蝌蚪的毒害主要通過破壞鰓結構來影響其呼吸方式，從而使其功能紊亂，中毒死亡;還因蝌蚪皮膚的滲透性強，溶液中的Cu2+易滲進皮膚，破壞內臟器官功能，導致其中毒。經以上分析可知，蝌蚪對外界環境敏感，故蝌蚪可作為環境監測的重要指示動物。因此，該試驗不僅可為水環境監測及棘腹蛙蝌蚪的相關研究提供參考，也可為保護棘腹蛙蝌蚪提供基礎數據材料。

國內關于Cu2+對兩棲動物的急性毒性研究較少，這里列出國內已有的Cu2+對不同兩棲類蝌蚪的LC50（表4），LC50越大，毒性越小，蝌蚪耐受性更強。

不同種類的蝌蚪體長及質量與LC50并未呈現出線性關系。對于同一種蝌蚪，隨著時間的延長，LC50變小。這可能是隨著時間的延長，體內毒性增強，耐受性減弱。

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