人內皮型一氧化氮合酶結構和功能的生物信息學分析▲

鄭 洋 王佳慧 汪 磊 梁天堅 趙鐵建,2 李成林

(廣西中醫藥大學1 賽恩斯新醫藥學院醫學系，2 基礎醫學院生理教研室，南寧市 530222，電子郵箱：1793853705@qq.com)

內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)可以調控體內一氧化氮(nitric oxide,NO)的生成，而NO是調控血管舒張功能最重要的因素[1]。NO是在一氧化氮合酶催化下，L-精氨酸轉化為L-瓜氨酸時產生。血管內皮細胞合成NO后擴散至血管平滑肌細胞，激活該細胞上的鳥苷酸環化酶，催化三磷酸鳥苷產生環磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)，介導平滑肌舒張，從而導致血管舒張，這一分子信號傳導路徑被稱為eNOS-NO-cGMP通路[2]。有研究表明，eNOS-NO-cGMP通路在肝竇內皮細胞窗口的形成過程中發揮十分重要的作用，而核因子κB信號通路可以通過調控eNOS基因的轉錄來控制NO的生成，說明eNOS基因在eNOS-NO-cGMP通路上具有關鍵作用[3-6]。本課題組一直致力于研究廣西道地藥材莪術抗肝纖維化的作用機制，已經發現莪術主要活性成分莪術醇對肝竇內皮細胞的窗口和基底膜有影響[7]，但是具體的作用機制仍不清楚。本研究利用生物信息學方法深入分析eNOS基因及其所編碼的蛋白質，為研究莪術與肝竇內皮細胞作用關系提供生物信息學方面的理論支持。

1 資料和方法

1.1 數據來源 在NCBI數據庫的GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中獲取eNOS基因的核酸序列，在UniProt蛋白質數據庫(https://www.uniprot.org/)中獲取eNOS蛋白的氨基酸序列。

1.2 分析方法 (1)用BDGP(http://www.fruitfly.org/)和TFDB在線數據庫(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/AnimalTFDB/)進行啟動子和轉錄因子的預測，前者是基于神經網絡和遺傳算法的在線數據庫，用于模擬轉錄因子與啟動子區域序列的相互作用。(2)用ProtParam在線工具(https://web.expasy.org/protparam/)分析eNOS基因所編碼蛋白的理化性質；用ProtScale在線軟件(https://web.expasy.org/protscale/) 分析蛋白質的親水性和疏水性。(3)用SignalP 4.1軟件來預測蛋白質的信號肽，通過對目的肽鏈前70個氨基酸間潛在酶切位點的預測來判斷是否存在信號肽。設置臨界值為0.450，預測C分值、Y分值、S分值，其中S的平均值可以用來判斷是否為分泌蛋白(S>0.5則判斷為分泌蛋白并且有信號肽)，Y的最大值用來判斷信號肽的剪切位點[8]。(4)用TMHMM軟件[9]來分析蛋白質的跨膜結構，只有位于膜外區域的氨基酸序列才有可能作為抗原的表位，而其他兩個區域的氨基酸序列一般不會作為抗原表位[10]。(5)用SOPMA數據庫(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)預測蛋白質二級結構；用SWISS-MODEL數據庫(https://swissmodel.expasy.org/)來預測蛋白質的三級結構。(6)在真核細胞中，蛋白質被基因翻譯后還要進行加工才能發揮其功能，比較常見的加工方式有磷酸化和糖基化等，這種加工對于蛋白質發揮功能具有十分重要的意義，因此應用NetNGlyc1.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)和NetOGlyc4.0 Server在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)分別對蛋白質N-糖基化和O-糖基化位點進行分析；由于蛋白質的磷酸化修飾對于信號傳導具有十分重要的意義，因此應用NetPhos2.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)對蛋白質磷酸化位點進行分析。(7)用STRING數據庫(https://string-db.org/cgi/input.pl)預測蛋白質的相互作用。(8)用BLAST數據庫(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對eNOS基因進行同源性分析。

2 結 果

2.1 eNOS基因的啟動子和轉錄因子預測結果 在NCBI數據庫中檢索eNOS基因，發現其位于7q36.1區，含有28個外顯子。用BDGP在線數據庫來預測啟動子區域，設置Score為0.9，預測得到的啟動子見表1。選取評分最高的一段啟動子用TFDB數據庫進行轉錄因子預測，評分較高的前10位轉錄因子見表2。

表1 eNOS基因啟動子預測結果

表2 評分最高啟動子結合的轉錄因子

2.2 eNOS基因編碼蛋白質的理化性質 通過UniProt數據庫獲得eNOS基因編碼蛋白質的氨基酸序列，然后將其輸入到ProtParam數據庫中，對其理化性質進行預測。eNOS蛋白質分子量為133 274.78，蛋白質的總分子式為C5930H9269N1677O1734S46，總原子數為18 656，含有1 203個氨基酸殘基。其中，帶正電荷的氨基酸殘基精氨酸(Arg)和賴氨酸(Lys)占10.47%(126/1 203)；帶負電荷的氨基酸殘基天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)占10.64%(128/1 203)。理論上等電點=6.94，說明eNOS蛋白偏中性。氨基酸組成中亮氨酸(Leu)含量最高，達到10.6%。eNOS蛋白的不穩定指標達到了53.49，屬于不穩定的蛋白質。eNOS蛋白的脂肪指標為79.48。再依托ProtScale軟件檢測該蛋白質的親水和疏水性，采用Hphob./Kyte&Doolittle算法，結果顯示eNOS蛋白最大的疏水性分值為2.311，親水性最小的分值為-3.444，eNOS蛋白疏水性的氨基酸分值小于親水性的氨基酸(見圖1)，因此eNOS蛋白總體上屬于親水性蛋白。

圖1 eNOS蛋白親水性和疏水性分析結果

2.3 eNOS蛋白信號肽的分析 運用SignalP 4.1軟件進行分析，結果顯示，C的最大值為0.076，Y最大值為0.073，S最大值為0.216，其預測的剪切點在33位氨基酸。S平均值為0.088，說明eNOS蛋白不是分泌蛋白并且也沒有信號肽。見圖2。

圖2 eNOS蛋白信號肽分析結果

2.4 eNOS蛋白跨膜結構的分析 將eNOS蛋白的氨基酸序列輸入到TMHMM軟件進行跨膜結構的預測。由圖3可見，eNOS蛋白全部在膜外，沒有在跨膜區和細胞內。

圖3 eNOS蛋白跨膜區的預測結果

2.5 eNOS蛋白二級結構的預測結果 用SMOPA數據庫來預測蛋白質的二級結構，將構象數設置為3(Helix、Sheet、Coil)，其他的參數默認為原始數據。結果顯示，α螺旋、β折疊和無規則卷曲各占37.52%、15.39%、47.09%，見圖4。其中α螺旋所占比重較高，這有利于維持蛋白質的穩定構象，而無規則卷曲常在蛋白質分子的表面，有利于抗原和抗體的相互作用。

圖4 eNOS蛋白二級結構的預測結果

2.6 eNOS蛋白的三級結構預測結果 用SWISS-MODEL數據庫來預測蛋白質的三級結構，運用同源建模的方法來預測結構，與數據庫中已有的蛋白質進行序列的對比，選擇相似度高的模型建模，預測的結果見圖5，該蛋白質存在較多的扭曲和折疊,結構較為豐富,而這些結構對其生物學功能的發揮有重要作用。

圖5 eNOS蛋白三級結構和同源性蛋白質相似性波形圖

2.7 eNOS蛋白翻譯后的加工 分別運用NetNGlyc1.0 Server和NetOGlyc4.0 Server在線軟件對N-糖基化和O-糖基化位點進行分析，結果顯示在該段序列上沒有N-糖基化位點(見圖6)，O-糖基化位點位于第6、33、39、44、53、56、57、60、102、114、424、483、488、491、495、599、600、624、625、633、634、636、725、729、738、824、836、920、1171位。用NetPhos2.0 Server進行蛋白質磷酸化位點的預測，預測結果為有Ser:35，Thr:14，Tyr:4可以成為磷酸化的位點，見圖7。

圖6 eNOS蛋白N-糖基化分析

圖7 eNOS蛋白磷酸化的分析結果

2.8 eNOS蛋白的相互作用 借助STRING數據庫預測蛋白質的相互作用，預測eNOS蛋白可以與10個蛋白發生相互作用。其中，eNOS蛋白可以與α-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(alpha serine/threonine-protein kinase 1，AKT1)和血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)發生作用(見圖8)，前者在血管生成過程中發揮重要的調控作用，后者對血管內皮細胞的各種生理活動都有調節作用，說明eNOS蛋白與血管的各種生理活動關系密切。其他相互作用蛋白都可以協同eNOS蛋白的功能。

圖8 eNOS蛋白相互作用的預測結果

2.9 人eNOS基因同源性分析 將人、小鼠、豬、大鼠、羊、馬、牛、兔子、狗的eNOS基因序列導入Blast數據庫進行基因序列分析，9個物種的eNOS基因序列相似度較高，處于75.95%～90.04%之間。其中人與豬的eNOS基因序列相似度最高(為86.22%)，與馬的基因序列相似度最低(為75.95%)，其他各物種之間相似度比較結果見表3。

表3 不同物種eNOS基因序列相似度比較

3 討 論

本研究運用生物信息學的各種軟件，對eNOS基因及其編碼的蛋白質進行了詳細的分析，發現其具有以下特點：eNOS基因高得分的啟動子有14個，SPl1是得分最高的轉錄因子；eNOS基因編碼的蛋白質是不穩定親水性偏中性的蛋白質，其不是分泌蛋白，也沒有信號肽，全部分布在膜外，說明其可以作為受體參與信號傳導的過程；eNOS蛋白的二級結構中α螺旋所占比重較高，這有利于維持蛋白質的穩定，且其三級結構較為復雜，說明其功能具有多樣性；O-糖基化位點有29位，Ser:35、Thr:14、Tyr:4可以成為磷酸化的位點，這些修飾位點可以對蛋白質的功能進行調節；同源性分析結果雌雄激素受體1提示eNOS基因的進化上具有一定的保守型，并且人與豬的eNOS基因序列相似度最高，為86.22%，與馬的基因序列相似度最低，為75.95%。

進一步行蛋白質的相互作用分析，結果顯示，eNOS蛋白可以與10個蛋白質發生相互作用，說明這些蛋白與eNOS蛋白在功能上有聯系。其中雌激素受體1參與調控真核細胞基因的表達，影響靶細胞的增殖和分化，雌激素受體1可以抑制核因子κB信號通路的活化，從而減少白細胞介素6等的表達[11-12]。血管內皮生長因子在血管生成、血管發育、血管通透性、胚胎造血等方面起著重要的調節作用，其可促進內皮細胞的增殖、存活、遷移和分化，以及肌動蛋白細胞骨架的重組，并可介導絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)1/細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)2、MAPK3/ERK1和MAPK信號通路以及AKT1信號通路的激活，以及磷酸肌醇-3-激酶調節亞單位1的磷酸化、磷脂酰肌醇3-激酶的調節亞基、肌動蛋白骨架的重組和蛋白酪氨酸激酶2/局部黏著斑激酶的激活[13-15]。VEGFA在血管生成內皮細胞生長中起積極作用，其可誘導內皮細胞增殖，促進細胞遷移，抑制凋亡，調控血管通透性[16]。90 kDa熱休克蛋白αA1可以在3個水平上調節轉錄：首先，它們改變某些轉錄因子的穩態水平，以應對各種生理刺激；其次，它們調節某些表觀遺傳修飾物(如組蛋白脫乙酰酶或DNA甲基轉移酶)的活性，從而對環境的變化做出反應；再次，它們參與將組蛋白從某些基因的啟動子區域逐出，從而啟動基因表達[17]。此外，90 kDa熱休克蛋白αA1還可以與細菌脂多糖結合，介導脂多糖誘導的炎癥反應[18]。AKT1為AKT激酶的3種緊密相關的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT1、AKT2和AKT3)之一，它調控著細胞的代謝、增殖、細胞存活、生長和血管生成等多種過程，而這是通過絲氨酸和(或)蘇氨酸磷酸化一系列下游底物來介導的[19]。小窩蛋白1可以充當支架蛋白的作用，參與T細胞受體介導的T細胞活化所必需的共刺激信號；它與二肽基肽酶4的結合以T細胞受體/CD3依賴的方式誘導T細胞增殖和核因子κB的活化[20]。一氧化氮合酶運輸因子是一種多價適配蛋白，可通過使蛋白其遠離質膜而降低目標蛋白的活性[21]。精氨酸酶Ⅱ可能在調節尿素外循環、精氨酸代謝和降低NO合成方面發揮作用，肝外的精氨酸酶對一氧化氮合酶的生物利用度有調節作用，精氨酸代謝是天然免疫和適應性免疫反應的關鍵調節因子，可以通過調節核糖體蛋白S6激酶B1信號傳導，促進內皮細胞衰老，并導致一氧化氮合酶3/eNOS功能障礙[22-23]。鈣調蛋白1通過鈣結合介導大量酶、離子通道、水通道蛋白和其他蛋白質的調控，而鈣調素-鈣復合物刺激的酶包括許多蛋白激酶和磷酸酶[24]。激肽原1在凝血過程中以及對血管通透性和炎癥因子產生等方面發揮重要的調節作用[25]。

eNOS是NO合成的關鍵酶，而NO又是調控血管功能的關鍵因子，因此eNOS是所有與血管相關疾病研究的重要靶點。通過對人基因eNOS及其所編碼蛋白質的深入分析，我們對其有了更加深入的了解， eNOS具有利于蛋白間相互作用的結構特點和在細胞膜定位的特點，表明其具有傳遞信息的功能，這或可為后期的基礎研究提供一個科學導向。