常溫和冰凍保存條件下單采血小板制品凝血功能的差異▲

鐘周琳 周 燕 盧 芳 李麗蘭 李恒聰 蔣麗紅 陳潔潤 吳國光

(廣西南寧輸血醫學研究所，南寧市 530007，電子郵箱：zhzhl2000@126.com)

血小板制品在創傷、血液系統疾病、腫瘤等患者中的應用越來越廣泛，而通常血小板于(22±2)℃(常溫)振蕩條件下僅能保存5 d，因此臨床常面臨血小板制品短缺的問題。此外，與其他血液制品相比，常溫保存的血小板制品的細菌污染風險更高，而病原體滅活技術可降低此風險[1-3]。血小板保存損傷成為解決血小板保存問題的瓶頸，隨著保存時間的延長，血小板發生一系列代謝活動，影響血小板質量及功能[4]。-80℃冰凍保存可減少血小板的代謝活動，延長血小板保存時間，但是凍融過程可能會改變血小板構象。目前用于檢測血小板制品質量的常規指標僅有血小板計數、pH值等。血栓彈力圖(thromboelastogram，TEG)通過檢測血栓粘彈力，分析血小板、纖維蛋白、凝血因子等在凝血、纖溶等過程的相互作用，檢測原理更接近血小板在人體內的生理學功能。本研究應用TEG、流式細胞術分析常溫和冰凍保存條件下的單采血小板活化、凋亡以及凝血功能的差異，現報告如下。

1 資料和方法

1.1 樣本來源 選取2017年6月至2019年4月南寧中心血站單采血小板16份，獻血者男女比例為1 ∶1，年齡18～55歲，符合《獻血者健康檢查要求》，獻血前5 d內未服用抑制或損害血小板功能的藥物(如含阿司匹林或阿司匹林類藥物)。應用無菌接管技術將每份單采血小板樣本分成8份，其中4份于(22±2)℃下振蕩保存在一次性使用血小板常溫保存袋中，分別于采集當日、第3天、第5天及第8天進行檢測；另外4份置于凍存管中，加入100 μL終濃度為5%的二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)后于-80℃保存，分別于保存第3天、第5天、第8天及1年將樣本置于37℃水浴溶解后進行檢測。獻血者對本研究知情同意，本研究經南寧中心血站倫理委員會審查同意。

1.2 試劑與儀器 TEG Hemostasis System Kaolin試劑盒(美國Haemoscope公司，批號：HMO400、HMO4134)，藻紅蛋白標記的CD62P抗體(美國BD公司，批號：7135680)，異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)-膜聯蛋白V(Annexin V)(美國BD公司，批號：7298795)，一次性使用血小板常溫保存袋(四川南格爾生物醫學股份有限公司，批號：170608)，DMSO(美國Sigma公司，批號：SHBG6226V),多聚甲醛(天津市博迪化工有限公司，批號20150415)，TEG5000血栓彈力圖儀(美國Haemoscope公司)，FACSCalibur流式細胞儀(美國BD公司)， Sysmex XT-2000i五分類血細胞分析儀(日本Sysmex公司)。

1.3 血小板計數及平均血小板體積的檢測 將樣本顛倒混勻后，采用五分類血細胞分析儀檢測獲得血小板計數及平均血小板體積(mean platelet volume，MPV)，操作按說明書執行。

1.4 TEG檢測 將樣本及含高嶺土、混合磷脂等成分的TEG Hemostasis System Kaolin試劑盒分別置于室溫平衡15 min后，取1 000 μL樣本加入試劑盒中，輕輕顛倒混勻5次，吸取330 μL樣本加入含30 μL 0.2 mol/L氯化鈣的TEG上樣杯中，在37 ℃、CK模式下檢測60 min，記錄凝血時間、最大振幅、 α角、凝血指數等數據。

1.5 流式細胞術檢測血小板CD62P表達水平 采用流式細胞術檢測血小板CD62P表達水平以評價血小板的活化程度。將血小板(106個細胞)與10 μL藻紅蛋白標記的CD62P抗體混勻后室溫避光孵育15 min，加入1 mL 1%多聚甲醛固定液，充分混勻，2℃～8℃避光放置30 min。24 h內用流式細胞儀獲取10 000個血小板以分析CD62P表達水平。

1.6 流式細胞術檢測血小板磷脂酰絲氨酸暴露水平 血小板凋亡早期磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)外翻至細胞膜表面，而Annexin V是鈣離子依賴性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力特異性結合，因此采用熒光標記的Annexin V通過流式細胞術可檢測PS的暴露水平，從而評價血小板的凋亡情況[5]。將血小板(106個細胞)、5 μL FITC-Annexin V、100 μL 1×結合緩沖液混勻，室溫避光孵育15 min，加入400 μL 1×結合緩沖液后立即用流式細胞儀獲取10 000個血小板以分析Annexin V結合率。

1.7 統計學分析 采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示，重復測量計量資料的比較采用重復測量方差分析，兩兩比較采用t檢驗。以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 常溫和冰凍保存對血小板計數和MPV的影響 在采集后第3天、第5天、第8天，兩組的血小板計數比較，差異無統計學意義(F組間=0.024，P組間=0.879)；兩組的血小板計數均無隨時間變化的趨勢(F時間=2.419，P時間=0.115)；分組與時間無交互效應(F交互=0.445，P交互=0.582)。兩組的MPV比較，差異無統計學意義(F組間=3.445，P組間=0.073)；在采集后第3天、第5天、第8天，兩組的MPV均有隨時間變化的趨勢(F時間=23.895，P時間<0.001)；分組與時間有交互效應(F交互=7.770，P交互=0.002)。見表1。

表1 常溫和冰凍保存下血小板制品各指標的差異(n=16，x±s )

2.2 常溫和冰凍保存對TEG相關指標的影響 在采集后第3天、第5天、第8天，兩組的凝血時間、凝血指數比較，差異有統計學意義(F組間=251.094、31.763，均P組間<0.001)，各時點冰凍保存的血小板制品凝血時間低于常溫保存的血小板制品凝血時間(P<0.05)，在采集后第5天、第8天時，冰凍保存的血小板制品凝血指數高于常溫保存的血小板制品凝血指數(P<0.05)；兩組的凝血時間、凝血指數均有隨時間變化的趨勢(F時間=22.458，P時間<0.001；P時間=7.153，P時間=0.002)；分組與時間均有交互效應(F交互=34.039、15.805，P交互<0.001)。在采集后第3天、第5天、第8天，兩組的最大振幅、 α角比較，差異均無統計學意義(F組間=0.355，P組間=0.556；F組間=0.402，P組間=0.531)；兩組的最大振幅有隨時間變化的趨勢(F時間=8.561，P時間=0.001)，α角無隨時間變化的趨勢(F時間=0.974，P時間=0.383)；最大振幅和α角分組與時間均無交互效應(F交互=0.743，P交互=0.457；F交互=0.642，P交互=0.530)。見表1。

2.3 常溫和冰凍保存對血小板CD62P表達水平的影響 在采集后第3天、第5天、第8天，兩組的血小板CD62P表達水平比較，差異有統計學意義(F組間=24.877，P組間<0.001)，其中在采集后第5天、第8天時，冰凍保存的血小板CD62P表達水平低于常溫保存的血小板CD62P表達水平(P<0.05)；兩組的血小板CD62P表達水平均有隨時間變化的趨勢(F時間=172.437，P時間<0.001)；分組與時間有交互效應(F交互=89.653，P交互<0.001)。見表1。

2.4 常溫和冰凍保存對血小板PS暴露水平的影響兩組的血小板Annexin V結合率比較，差異有統計學意義(F組間=144.471，P組間<0.001)，其中在采集后第3天、第5天、第8天時冰凍保存的血小板Annexin V結合率高于常溫保存的血小板Annexin V結合率(P<0.05)；兩組的血小板Annexin V結合率均有隨時間變化的趨勢(F時間=221.275，P時間<0.001)；分組與時間有交互效應(F交互=25.781，P交互<0.001)。見表1。

3 討 論

常溫[(22±2)℃]振蕩保存的血小板可吸收血液保存液中的葡萄糖，通過透氣性血袋與外界交換氣體，完成有限的能量代謝。然而，隨著保存時間的延長，血小板發生不同程度的活化、凋亡，導致血小板出現損傷。另外，常溫保存增加了細菌污染的風險，可導致嚴重的輸血不良反應[6-7]。盡管低溫保存的血小板發生分子結構和形態上的改變，但是其保存期長，可緩解血小板制品供應緊張的問題[8-11]。血小板的低溫保存可分為冷藏保存(2℃～6℃)和冰凍保存(-80℃)，其中冰凍保存血小板的應用更為廣泛。美國食品藥品監督管理局已認可DMSO作為冰凍血小板的保護劑，荷蘭也在軍隊中應用冰凍血小板進行輸血治療[8,12]。

本研究結果顯示，兩組的血小板計數比較，差異無統計學意義(P>0.05)，兩組的血小板計數均無隨時間變化的趨勢(P>0.05)，分組與時間無交互效應(P>0.05)；兩組的MPV比較，差異無統計學意義(P>0.05)，兩組的MPV均有隨時間變化的趨勢(P<0.05)，分組與時間有交互效應(P<0.05)，提示兩種保存方法對血小板體積都有影響，但差異不大。在采集后第3天、第5天、第8天，冰凍保存的血小板制品凝血時間低于常溫保存的血小板制品(P<0.05)；同時兩組的凝血時間均有隨時間變化的趨勢(P<0.05)，其中常溫保存的血小板制品的凝血時間隨保存時間的推移而升高，即血小板制品中的凝血因子逐漸失活，然而冰凍保存的血小板制品的凝血時間隨保存時間延長而縮短，凝血活性增強，這與常溫保存的血小板的變化趨勢相反。此外，采集后第3天、第5天、第8天時，兩組血小板Annexin V結合率均隨保存時間延長而升高，其中在各時點冰凍保存的血小板Annexin V結合率均高于常溫保存的血小板(P<0.05)，提示冰凍保存過程中血小板PS高度暴露。而PS是一種促凝因子，可與凝血因子Xa結合使凝血酶生成增加，促進血液凝塊的形成[13]，這可能是冰凍血小板凝血時間縮短的原因。此外，冰凍保存過程中血小板PS的高度暴露可能會導致血小板輸入人體后很快被清除出循環系統，而如何延長冰凍血小板在體內存活時間，避免被快速清除，仍需進一步的動物實驗和臨床應用研究以探討[14-15]。

最大振幅、α角是反映血小板功能的主要TEG指標，本研究中兩組的最大振幅、 α角比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；兩組的最大振幅有隨時間變化的趨勢(P<0.05)，α角無隨時間變化的趨勢(P>0.05)；分組與時間均無交互效應(P>0.05)，提示隨著時間的推移，最大振幅均發生變化，但兩種保存方法差異不大。凝血指數可反映血液總體凝血情況，本研究中在采集后第5天、第8天，冰凍保存的血小板凝血指數均高于常溫保存的血小板(P<0.05)，其中在采集后第8天時常溫保存的血小板凝血指數<-3.0，提示處于低凝狀態，而冰凍保存1年后凝血指數仍在正常水平(正常值范圍：-3～3)，顯示了冰凍保存保存時間長的優越性。此外，采集后各時點，兩組血小板CD62P表達水平均隨保存時間延長而升高，其中在保存第5天、第8天時冰凍保存的血小板CD62P表達水平低于常溫保存的血小板CD62P表達水平(P<0.05)，提示血小板制品隨保存時間的延長發生明顯活化，而冰凍保存的血小板活化程度低于常溫保存，因此冰凍保存對血小板制品的長期保存更具有優勢。

綜上所述，與常溫保存的單采血小板相比，冰凍保存的單采血小板制品PS暴露水平更高、凝血活性更強，具有更穩定的凝血功能，可用于治療因創傷等需要即刻止血的患者；且保存期更長，可作為常溫保存血小板制品的補充，以緩解血小板保存期短的難題。