三個產地‘赤霞珠’葡萄果實風味物質差異性研究

楊洋，張亞紅*，李鵬，胡澤軍，張曉麗

（寧夏大學農學院，寧夏銀川 750021）

近些年來，隨著我國葡萄產業快速發展，其產業規模已超過西歐傳統葡萄主產國而名列前茅，是我國栽培區域最廣的落葉果樹[1]。中國是葡萄的起源中心之一，葡萄栽培與葡萄酒釀造已有千年歷史。如今，我國葡萄與葡萄酒產業伴隨著“一帶一路”戰略正迅速崛起[2]，逐步形成東北、京津冀、山東、新疆、賀蘭山東麓等優質釀酒葡萄原料產區。葡萄漿果的風味物質與產地密切相關，在品種、樹齡、栽培管理方式一致條件下，釀酒葡萄產區的氣候、地形、土壤等風土條件是影響果實風味物質及葡萄酒風格與典型性的重要因素[3]，其中氣候影響最大。眾所周知，新疆產地葡萄成熟期晝夜溫差大，果實含糖量高，但白天高溫使酸發育不良，香氣和著色都受到不利影響。而山東產地晝夜溫差小，糖度低，亦對葡萄酒風格不利。寧夏釀酒葡萄產地的晝夜溫差介于新疆和山東產地之間，因此研究三個產地間釀酒葡萄漿果風味物質的差異性，可以從另一方面解釋溫度對釀酒葡萄品質的影響。

研究發現，葡萄果實中花色苷組成和比例受品種和產地的影響，且產地環境因素的影響大于品系自身特性的影響[4]。崔日寶等[5]對河西走廊不同產地‘赤霞珠’的研究也得到了相似的結論。這是因為產地環境因素會影響花色苷的合成與積累，從而使葡萄果實的花色苷組成具有地域差異。研究發現，山地葡萄果實含糖量、含酸量和單寧含量均高于平地，且海拔越高，差異越大[6]，這可能與溫度及土壤水分有關。溫度對釀酒葡萄果實含糖量的升高及含酸量的降低均有促進作用[7]，白天氣溫高導致酸含量降低，糖酸比例不協調，會使所釀出來的葡萄酒品質下降[8]。光照對葡萄果實中單寧含量影響最大，其次是總花色苷含量[9]。葡萄果實成熟度對產地降水量較為敏感，降水過多會造成果皮多酚類物質含量下降[10]。葡萄果實的風味物質主要有甜味、酸味和香味[11]，香氣物質主要存在于果皮中，而冷涼環境有助于香氣物質的積累[12]。光照會影響葡萄果實的代謝產物，若紫外照射減少，降異戊二烯類物質含量會降低[13]。

‘赤霞珠’是世界范圍栽培最廣泛的釀酒葡萄品種，也是我國栽培面積最大的品種，因此在我國葡萄酒產品中具有不可替代的位置。新疆、山東和寧夏是我國主要的葡萄酒產區，氣候、土壤等環境條件差異顯著，因此生產中應根據風味物質的產生規律采取與之相適應的栽培管理模式，從而釀造出具有鮮明地域風格的葡萄酒產品，推動我國葡萄酒產業的建康發展。因此，本試驗通過3個產地‘赤霞珠’葡萄果實風味物質的比較研究，以期為釀酒葡萄選擇最佳的栽培地區，生產高品質葡萄漿果及釀造具有產地風格特征的葡萄酒提供依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及產地概況

2019年9月底至10月初在新疆石河子市北泉鎮、山東蓬萊市劉家溝鎮、寧夏銀川市西夏區（以下分別簡稱新疆、山東、寧夏），采集大面積種植的7～8年生釀酒葡萄‘赤霞珠’樣品，著重考慮各地栽培管理、生長年限、架式等的一致性。在‘赤霞珠’果實收獲期，根據各產地果實可溶性固形物及果實種子顏色確定成熟度。取樣時按照隨機摘取及具有涵蓋代表性的原則于每個產地整穗采樣約4 kg。葡萄果實長途運輸中采用干冰冷藏。樣品到達實驗室后，每產地分別從果穗上、中、下3個部位隨機剪取果粒300粒，每產地3個生物學重復。并于當日用果實鮮樣測定粒質量、pH和可滴定酸等相關理化指標，其余樣品液氮冷凍打磨存于﹣80 ℃冰箱，用于測定可溶性糖、單寧、花色苷、揮發性香氣物質等。

新疆產地位于東經8 4°5 8′～8 6°2 4′，北緯43°26′～45°20′，平均海拔450 m左右，年平均氣溫7～8 ℃，年降水量為125.0～207.7 mm，無霜期為168～171 d，大于10 ℃的活動積溫為3570～3729 ℃，年日照時數為2721～2818 h；土壤多系沙壤土、沙質土、灰漠土；日照充沛，氣溫日較差大，屬于典型溫帶大陸性干旱氣候。山東產地位于東經119°34′～121°57′，北緯36°16′～38°23′，海拔在100～300 m，年平均降水量600～800 mm，年平均氣溫11.9 ℃，年平均日照時數2826 h，無霜期平均210 d以上；土壤以花崗巖風化形成的沙壤土為主；雨水適中、氣候溫和，屬溫帶季風氣候。寧夏產地位于北緯38°08′～38°53′，東經105°49′～106°18′，海拔在1010～1150 m，年平均氣溫8.5 ℃左右，全年平均氣溫較差為13.1 ℃，年平均日照時數3000 h左右，年平均降水量200 mm左右，無霜期170 d左右；土壤為灰鈣土、灰褐土及灌淤土；光照充足，晝夜溫差大，屬于中溫帶干旱氣候區。

1.2 實驗試劑及儀器

氯化鈉、醋酸鈉、碳酸鈉、濃鹽酸、氯化鉀、甲醇、蒽酮，國藥集團化學試劑有限公司；鄰苯二酚、單寧酸、福林-酚試劑、福林-丹尼斯試劑，無錫耐思生物科技有限公司；C5-C30烷烴標準品均為色譜純，美國Sigma-Aldrich公司；

FA-1004電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；5804R低溫冷凍離心機，德國Eppendorf公司；UV 757紫外可見分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司；Agilent 6890N-5975B氣質聯用儀，美國安捷倫公司；100 μL PDMS固相微萃取針，美國Supelco公司。

1.3 葡萄果實理化指標的測定

采用手持糖量計測定可溶性固形物；酸堿滴定法測定可滴定酸含量[14]；可溶性糖測定采用蒽酮硫酸比色法[15]；總酚的測定采用福林酚法[16]，單寧的測定采用福林-丹尼斯法[17]；花色苷的測定用pH示差法[18]。參考楊夫臣等[19]的方法測定類黃酮的含量。

揮發性香氣成分的測定采用頂空固相微萃取方法提取，運用氣相色譜與質譜聯用技術（G a s Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）分析，參照楊曉帆[20]的方法并稍加修改。前處理：稱取適量液氮打磨樣品置于頂空瓶中，加3 g氯化鈉，密封，于80 ℃下水浴平衡30 min，用固相微萃取針萃取30 min，待萃取結束后，萃取針在進樣口解吸5 min。色譜柱：HP-5MS（30m×0.25mm×0.25μm）；分流比：不分流；載氣流速：1.0 mL/min；進樣口溫度：250 ℃；掃描方式：全掃描；離子源溫度：230 ℃；四級桿溫度：180 ℃；升溫程序為起始溫度：45 ℃，保持3 min，以5 ℃/min的速率升至200 ℃，保持6 min，再以30 ℃/min的速率升250℃，保持4 min。采集到的質譜圖利用NIST譜庫進行檢索，鑒定樣品中的揮發性成分，并利用峰面積歸一化法分析各成分的相對含量。

1.4 數據處理

試驗數據的整理、匯總和初步分析在WPS 2019中完成，進一步釆用Origin 2018軟件進行顯著性方差分析、主成分分析（PCA）及偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）。

2 結果分析

2.1 三個產地‘赤霞珠’果實中糖、酸含量

由表1所知，不同產地成熟時果實中的糖、酸含量存在差異。三個產地的果實粒質量在顯著差異，且表現為寧夏＞山東＞新疆；果實中可溶性糖含量新疆顯著高于寧夏約14.1%，而寧夏與山東沒有顯著差異。三個產地果實可滴定酸含量之間均有顯著差異，且呈現寧夏最高，新疆次之，山東最低。糖酸比是漿果成熟度的一項度量標準，即可溶性糖與可滴定酸的比值。三個產區的糖酸比之間有顯著差異，新疆成熟度最高，山東次之，寧夏最低。

2.2 三個產地‘赤霞珠’果實中酚類物質

如表2所示，三個產地單寧和總酚的含量均存在顯著性差異，且表現為山東最高，寧夏次之，新疆最低。山東的單寧和總酚含量較寧夏分別高出5%和12.6%。新疆的單寧和總酚含量較寧夏分別低了10%和12.4%。三個產地間果實花色苷含量均存在顯著差異，且新疆較寧夏高12.9%，山東較寧夏銀川低13.7%。三個產地果實中的類黃酮含量沒有差異。

表1 三個產地‘赤霞珠’葡萄果實中糖、酸含量Table 1 Contents of sugar and acid of 'Cabernet Sauvignon' berries from different production regions

表2 三個產地‘赤霞珠’葡萄果實中酚類物質含量Table 2 Content of phenolic substance of 'Cabernet Sauvignon' berries from different production regions/(mg/g)

2.3 三個產地果實成熟時揮發性香氣物質比較

如表3所示，果實成熟時，不同產地果實中均檢測到醛類、酮類、萜烯類、醇類、酯類等揮發性成分，新疆、山東和寧夏分別有43、43、44種。醛類是果實揮發性組分的主要成分，山東的醛類化合物總的相對含量均高于新疆和寧夏，且山東醛類化合物種類數最多，新疆最少；香氣物質中的萜烯類和脂類化合物的相對含量占比較小，但其嗅覺感官閾值很低，對果實感官特性影響很大。山東的萜烯類化合物的相對含量高于新疆和寧夏，而新疆的脂類化合物的相對含量和種類數均高于山東和寧夏，而寧夏的醇類化合物相對含量最高。

如表4所示，三個產地果實中檢測到的共有揮發性物質為11種，其中4種為醛類物質。具有青草香味的反式-2-己烯醛和乙醛的相對含量是主要成分。在共有揮發性物質中，新疆、山東和寧夏果實中醛類物質總的相對含量分別為52.6%、48.5%和48.7%。帶有混合香氣且嗅覺閾值較低（2 ng/L）的β-大馬士酮，在山東果實中的相對含量均高于新疆和寧夏，分別約是新疆和寧夏的1.7倍和3.4倍。

圖1顯示，成熟時三個產地果實共有揮發性物質PCA和PLS-DA結果。PCA結果發現，PCA1和PCA2的貢獻率分別為63.23%和36.58%，累積貢獻率達到99.81%，能夠反映果實揮發性物質的總體狀態。三個產地的果實樣品可以被明顯分開，PCA1將山東和寧夏區分開，分別位于正半軸與負半軸；而新疆位于PCA2的正半軸，山東和寧夏位于負半軸。苯甲醛、1-辛醇和1-3二羥基丙酮對PCA1的影響最強；壬醛、反式-2-己烯醛和1-辛烯-3-醇對PCA2影響較強；因此三個產地間果實揮發性香氣物質有顯著差異。PLS-DA結果發現，三個產地果實中反式-2-己烯醛、苯乙醇、壬醛、5-羥基糠醛和1-辛烯-3-醇的差異最大，其得分均大于1.0，而其它成分得分均在1.0以下。新疆的反式-2-己烯醛、5-羥基糠醛和1-辛烯-3-醇的相對含量最高，山東的苯乙醇含量最高，而寧夏的壬醛含量大于新疆和山東。

表3 三個產地‘赤霞珠’葡萄果實揮發性物質種類及含量Table 3 Content of volatile substance and kinds of 'Cabernet Sauvignon' berries from different production regions

表 4 三個產地‘赤霞珠’葡萄果實中共有揮發性物質的含量Table 4 Content of common volatile substance of 'Cabernet Sauvignon' berries from different production regions

圖1 三個產地‘赤霞珠’果實共有揮發性物質PCA和PLS-DA分析Figure 1 PCA and PLS-DA in the common volatile compounds of 'Cabernet Sauvignon' berries from different production regions

3 討論與結論

影響葡萄果實風味物質的主要因素包括品種特性、生態因素和栽培管理方式等[21]。國內外許多學者已經證實不同產地同一品種葡萄果實品質具有地域特征性[5,22]。本文分析比較的‘赤霞珠’果實采集，三個不同產地，它們處于不同生態區，氣象條件與土壤狀況均不同。試驗結果發現，三個產地果實粒質量有顯著差異，且寧夏最大，新疆最小，這可能是產地降水、光照等因素影響果實的大小。果實中可溶性糖、蔗糖和花色苷含量，均表現為新疆顯著高于寧夏和山東，這可能是產地晝夜溫差大，會促進總糖的積累，有利于葡萄果實著色；果實中可滴定酸含量則是寧夏最高，山東最低，可能與高溫會加速降解果實內蘋果酸有關。因為在葡萄成熟過程中，新疆白天溫度高，山東晝夜溫度均很高。溫度對花青素和黃酮醇的濃度影響很大，但對果實單寧的積累沒有影響[23-24]。王秀琴等[25]研究認為，相同品種在不同產地酚類物質含量差異性顯著。本試驗發現，三個產地果實中單寧和總酚含量有顯著差異，且表現為山東最高，新疆最低，這可能與成熟季節不同產地除溫度外的其它環境因子有關，不同微氣候會使葡萄果實產生不同的、微妙的風味差異。

葡萄芳香物質受產地的影響很大，因此不同生態區的葡萄與葡萄酒都具有獨特的地域特征。本研究發現，三個產地檢測出的總揮發性物質種類數大致相同，但不同產地香氣組成有明顯差異。研究發現，冷涼地區葡萄果實中C6醛含量的積累更高[12]。而本試驗發現，山東果實中醛類化合物種類數和相對含量均高于新疆和寧夏，可能與溫度之外其他環境因素有關。也有研究發現，同一品種不同產地果實中萜烯類物質的組成比較接近[26]。本試驗中雖然三個產地萜烯類物質組成差異不大，山東果實萜烯類化合物總的相對含量明顯高于新疆和寧夏，可能是因為溫暖地塊果實中含有更高的單萜類物質[12]。萜烯類和酯類化合物在果實中的含量很小，但其感官閾值都很低，二者均會賦予果實品種香氣特征。試驗發現新疆，酯類化合物相對含量最高，而寧夏醇類化合物相對含量最高。可見，不同產地的環境因素對釀酒葡萄果實揮發性物質的影響是十分復雜的。

本試驗結果表明，三個產地間果實糖、酸含量和粒質量均存在顯著差異，含糖量為新疆最高，可滴定酸含量和粒質量均為寧夏最高，三個產地間果實酚類物質均存在顯著差異，果實中單寧和總酚含量均表現為山東最高，而花色苷含量則為新疆最高，山東最低；三個產地果實中檢測出的揮發性物質組成差異明顯。山東果實中醛類和萜烯類化合物種類數和相對含量最高，新疆果實中酯類化合物的種類數和相對含量最高，而寧夏果實中醇類化合物種類數和相對含量最高。因此，不同產地的風土條件及地域性決定同一釀酒葡萄品種果實風味物質的差異性。