甲基磺酸乙酯誘變對綠豆種子萌發及幼苗生長的影響

高營 閆強 袁星星 薛晨晨 陳新

摘要：通過對綠豆甲基磺酸乙酯（EMS）誘變試驗，為構建綠豆EMS誘變突變體群體提供參考，在拓寬綠豆的遺傳基礎、創造和利用新種質等方面具有重要意義。選用蘇綠1號綠豆種子為試驗材料，利用0、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%不同濃度的EMS對綠豆種子進行12 h的誘變，研究不同濃度處理條件下綠豆種子萌發及幼苗生長的影響。研究結果顯示，EMS濃度為0.4%處理12 h綠豆種子基本都具有萌發力，而EMS濃度為0.8%處理12 h已經使絕大多數綠豆種子喪失了萌發力;當濃度為0.6%的EMS溶液處理10 h，其萌發率為47.32%，符合半致死劑量，此時綠豆幼苗的株高、根長與對照相比分別降低了42.3%、44.8%。誘變處理后移栽20 d，出現葉片缺失、增加、卷曲皺縮、掌狀、葉緣不規則狀等表型。由此可見，綠豆的最佳誘變條件為：EMS濃度0.6%，處理時間10 d。

關鍵詞：甲基磺酸乙酯（EMS）;誘變;綠豆;種子萌發;半致死劑量

中圖分類號：S522.035.2

文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2020）16-0104-04

綠豆[Vigna radiata （Linn.） Wilczek]屬于豆科（Leguminosae）蝶形花亞科（Papilionaceae）豇豆屬（Vigna），染色體組為2n=22[1]。我國是綠豆種植的起源中心之一，在我國種植地域廣泛，種植量僅次于綠豆種植大國印度，并且在云南省、廣西壯族自治區、山東省、天津市等地均發現有野生綠豆生長[2]。近年來，隨著社會經濟的發展和人們生活水平的提高，人們對食物多樣性和均衡性也有了更高的要求。綠豆因其營養成分豐富、藥用價值高而愈來愈受到國內外廣大消費者的歡迎。但綠豆進行科學研究的時間較短，對綠豆進行專業研究的人員較少，相比其他作物，綠豆的科研進度相對較慢[3-4]。綠豆進行種質創新和新品種選育，是未來綠豆育種工作者亟需面對和解決的重要問題。甲基磺酸乙酯（EMS）誘變通過誘發等位基因位點上某個或者多個堿基突變的一種化學誘變劑，綜合誘變效果較佳。目前，已經在水稻、玉米、油菜、小麥、大豆等作物中廣泛應用，對推動作物種質資源創新、作物遺傳改良和基因組學研究起到了重要作用[4-5]。如利用EMS溶液處理水稻，成功獲得了24份半矮化性狀突變體，為水稻矮化育種提供了遺傳材料[6];通過EMS誘變構建普通小麥豫農201突變體庫，共包含722份突變材料，為小麥功能基因組研究和遺傳改良提供了重要基礎材料[7]。

不同作物的種子對誘變劑的耐受程度存在巨大差異，因此每種作物所選擇的誘變劑量和處理時間很難具有廣適性。國內外對綠豆遺傳育種及功能基因組學的研究相對水稻等作物明顯滯后。因此，明確一種行之有效創制綠豆突變體的方法，可為綠豆優異種質創制、新品種選育以及功能基因組學研究提供技術和材料支撐。本研究通過評價EMS不同濃度和時間誘變處理后綠豆蘇綠1號種子萌發和幼苗生長狀態，篩選出最佳誘變的條件，為后續大規模構建綠豆EMS突變體庫提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為蘇綠1號，由江蘇省農業科學院經濟作物研究所豆類作物研究室所提供;化學誘變劑為甲基磺酸乙酯（EMS），從Sigma公司購入。

1.2 綠豆種子誘變處理

1.2.1 EMS溶液配制 取磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）21.8 g、磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）6.08 g，溶解定容至1 000 mL，用NaOH溶液將pH值微調至7.0。將誘導劑EMS溶于該磷酸緩沖液中，配制成0、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%共5個濃度EMS溶液。選擇適宜EMS處理濃度0.6%，進行處理時間（分別為0、6、8、10、12 h）對綠豆種子萌發影響的試驗。

1.2.2 處理方法 人工挑選飽滿的蘇綠1號綠豆種子作為誘導劑處理材料，用以對比不同處理條件對萌發率和苗期性狀的影響，每個處理約使用200粒種子，用蒸餾水浸泡種子8 h。將浸泡后的綠豆種子放入配制好的EMS溶液中，置于脫色搖床中并在85 r/min 條件下遮光振蕩12 h[8]。處理結束后，倒掉容器中EMS溶液，添加5%Na2S2O3緩沖液，置于脫色搖床中沖洗10 min，該清洗步驟重復3次;重復處理結束后，用無菌水繼續清洗振蕩3次;將不同濃度EMS處理后的綠豆種子置于鋪有濕潤濾紙的培養皿中，再于25 ℃培養箱中培養3 d后觀察萌發情況。EMS最佳處理時間篩選方法“同上”。將誘變處理完畢的種子移栽到含有營養土的種植盆中種植，對植株表型變異進行記錄。

1.3 測定方法和指標

觀察種子的萌發情況，記錄每個處理的發芽數，并計算萌發率。處理后綠豆幼苗移植10 d，測量幼苗的株高、根長，拍照記錄

萌發率=供試種子發芽數/供試種子總 數×100%。

1.4 數據處理

采用SPSS 23.0統計軟件，對不同處理間種子萌發率、株高、根長等數據進行單因素方差分析，并進行多重比較（LSD），相關圖使用Excel制作。

2 結果與分析

2.1 EMS濃度對綠豆種子萌發的影響

依據其他植物EMS誘導劑濃度和處理時間最佳方案，初步選定EMS濃度0、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%（以質量分數計）5個濃度梯度和12 h作為處理條件，觀察并記錄綠豆種子的萌發情況（圖1-A）。結果表明，0.4% EMS處理12 h后綠豆種子萌發速度變慢，但是萌發率和對照相比沒有顯著降低（P>0.05）。當處理濃度為0.8%時，其發芽率由對照組的95%下降至9%，顯著降低了種子萌發率;而用1.2%、1.6% EMS處理種子，發芽率分別為2.35%、2.12%。試驗結果表明，EMS濃度為0.4%處理12 h綠豆種子基本上具有萌發活力，而0.8%處理12 h已經使絕大多數綠豆種子喪失了萌發力（圖1-B）。因此應進一步選擇介于 0.4%～0.8%之間的誘變濃度0.6%進行不同時間的處理分析。

2.2 EMS處理時間對綠豆萌發的影響

以濃度為0.6%的EMS溶液處理綠豆種子， 研究不同處理時間對綠豆萌發及幼苗生長的影響（圖2-A）。與對照相比，處理6 h綠豆的萌發率為83.05%。處理8、10、12 h綠豆萌發率分別為64.62%、47.32%、22.09%，且不同處理間存在極顯著差異（P<0.01）（圖2-B）。表明處理10 h時符合半致死劑量的條件。

2.3 EMS誘變對綠豆幼苗生長的影響

為了明確EMS誘變對綠豆幼苗生長的影響，將處理不同時間后的幼苗進行移栽，在正常環境條件下生長10 d后觀察幼苗的生長狀態（圖3-A）。移栽后10 d，處理6 h株高、根長與對照相比均未表現出顯著差異;處理8 h株高比對照降低15.6%，根長縮短36.2%，但與處理6 h差異不顯著，與對照差異極顯著（P<0.01）。當處理時間為10 h時，株高、根長分別降低了42.2%、44.8%（圖3-B、圖3-C），此時幼苗真葉展開，未見明顯生長異常，繼續對幼苗生長狀態進行觀察，發現移栽20 d后幼苗3出復葉表現出明顯的變異表型。與對照相比，處理 10 h 出現葉片缺失、葉片增加、卷曲皺縮、掌狀、葉緣不規則狀等表型（圖4），而處理12 h幼苗生長發育受到嚴重抑制，萌發的種子極少發育成幼苗。

3 討論與結論

EMS濃度對綠豆種子萌發率的影響研究表明，EMS溶液處理對綠豆種子的萌發有抑制作用，且濃度越高，抑制作用越明顯，該結論與EMS溶液處理廣金錢草種子的結果[9]一致。濃度過高或過低均會導致誘變效果不佳，濃度過高綠豆種子發芽率極低。高濃度處理導致種子的萌發機制破壞，產生過多的有害物質，細胞滲透壓不平衡，細胞失水導致種子不萌發。

確定種子的EMS誘變半致死劑量，根據設置的不同梯度的濃度和時間觀察幼苗的致死率，致死率達到50%左右時為佳[10]。羊草種子的EMS誘變處理以濃度為1.5%、處理時間12 h時的劑量為半致死劑量[11]。EMS誘變處理紅小豆的最佳組合為濃度0.7%、處理時間20 h[12]。通過0.6% EMS不同處理時間的試驗結果顯示，綠豆種子的萌發率與EMS溶液誘變處理時間呈負相關;當處理時間為 10 h 時，萌發率為47.32%，接近半致死劑量，初步斷定綠豆誘變的最佳時間為10 h。

EMS誘變處理不同品種的種子，會對其萌發和生長狀況造成不同程度的影響[10]。EMS誘導處理油菜種子時，對幼苗的抑制作用要弱于對根的抑制作用[13]。通過對處理后綠豆幼苗的株高、根長、葉形等表型分析可知，隨著處理時間的延長，株高降低幅度增加，根長縮短幅度稍不明顯，因此EMS誘變對株高的抑制效果強于根長;而且在處理時間為10 h時，出現葉片缺失、葉片增加、卷曲皺縮、掌狀、葉緣不規則狀等表型，變異類型最為豐富。本研究結果表明，誘變處理對綠豆種子的萌發及幼苗的生長具有抑制作用;EMS誘變處理綠豆種子的最佳條件為：濃度0.6%、處理時間10 h。

參考文獻：

[1]陳 新，袁星星，陳華濤，等. 綠豆研究最新進展及未來發展方向 [J]. 金陵科技學院學報，2010，26（2）：59-68.

[2]田 茜，張文蘭，李 群，等. 綠豆的品質特性及綜合利用研究進展[J]. 中國農學通報，2016，32（9）：77-82.

[3]溫日宇，劉建霞，宋亞靜，等. 疊氮化鈉對綠豆種子和幼苗生長的誘變效應[J]. 山西農業科學，2017（12）：1933-1936.

[4]王麗俠，程須珍，王素華. 綠豆種質資源、育種及遺傳研究進展[J]. 中國農業科學，2009，42（5）：1519-1527.

[5]劉 翔. EMS誘變技術在植物育種中的研究進展[J]. 激光生物學報，2014，23（3）：197-201.

[6]王 峰，徐 飚，楊正林，等. EMS誘變水稻矮生資源的鑒定評價[J]. 核農學報，2011，25（2）：197-201.

[7]徐艷花，陳 鋒，董中東，等. EMS誘變的普通小麥豫農201突變體庫的構建與初步分析[J]. 麥類作物學報，2010，30（4）：625-629.

[8]崔 霞，梁 燕，王玲慧. 不同濃度化學誘變劑甲基磺酸乙酯對番茄種子發芽的影響[J]. 北方園藝，2013（14）：28-30.

[9]梅凌鋒，唐艷梅，唐曉敏，等. 3種化學誘變劑對廣金錢草種子萌發的影響[J]. 廣東藥學院學報，2015，31（3）：310-315.

[10]崔清志，劉曉虹，陳惠明. EMS誘變技術研究進展[J]. 湖南農業科學，2013（5）：7-9，13.

[11]臧 輝，武自念，孔令琪，等. 甲基磺酸乙酯（EMS）誘變對羊草種子萌發及幼苗生長的影響[J]. 分子植物育種，2018，16（17）：5765-5769.

[12]劉建霞，溫日宇，劉文英，等. EMS不同處理濃度和時間對紅小豆誘變的影響[J]. 山西農業科學，2017，45（5）：715-717，721.

[13]原小燕，李加納，劉列釗. EMS對油菜種子萌發的影響[J]. 西南師范大學學報（自然科學版），2010，35（3）：217-221.