毛鉤藤堿調控IL-6/STAT3信號通路抑制結腸癌細胞增殖、遷移及誘導細胞凋亡的體外實驗

韓曉麗 席作武 王凱 楊傳廣

(河南中醫藥大學 1第二臨床醫學院，河南 鄭州 450000；2第二附屬醫院肛腸科)

結腸癌是常見的惡性腫瘤之一，其病情隱匿，發現時多是晚期，放化療也是目前有效的治療手段，但會產生一系列不良反應〔1〕。近年來隨著中醫藥的發展，它在治療結腸癌化療副反應上起到了一定作用，也取得了一定的進步〔2〕。鉤藤是我國傳統中藥，具有抗炎、抗病毒和免疫應激等效應，其主要活性物質為生物堿，而毛鉤藤堿是從鉤藤分離得到的一種有效生物堿，且毛鉤藤堿對心血管具有保護作用〔3〕。且研究發現鉤藤生物堿提取物及其單體成分不僅具有抑制多種腫瘤細胞增殖及促進腫瘤細胞凋亡等活性，還具有逆轉腫瘤多藥耐藥活性的作用〔4〕。白細胞介素(IL)-6、信號轉導和轉錄活化因子(STAT)3在結腸癌組織中均高表達，參與結腸癌的發生發展〔5〕。本研究旨在探討毛鉤藤堿對IL-6/STAT3信號通路的調控作用及其對結腸癌細胞增殖、遷移及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料 結腸癌細胞SW480購自中國科學院上海細胞庫；胎牛血清、RPMI1640培養基、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；Trizol試劑、反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司；MTT試劑盒、膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)試劑盒、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、放射免疫沉淀實驗(RIPA)蛋白裂解液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；抗體購自上海煊翎生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 結腸癌細胞SW480用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基于37℃、5% CO2飽和濕度條件下培養，每天換液一次，待細胞融和至70%左右時，加入胰蛋白酶進行消化傳代，選取對數生長期的細胞進行實驗。

1.2.2藥物處理與分組 參考翟娜娜等〔6〕所用的毛鉤藤堿濃度，當細胞融和至70%左右時，將細胞傳代接種至96孔板中，并用不同濃度的毛鉤藤堿(150、300、600 μmol/L)處理SW480細胞，設為毛鉤藤堿150 μmol/L組、300 μmol/L組、600 μmol/L組；未經任何處理的SW480細胞作空白對照(NC)組，DMSO處理SW480細胞作為DMSO組，5 mg/L紫杉醇處理SW480細胞作為陰性對照組，為TAX 5 mg/L組。

1.2.3噻唑藍(MTT)檢測細胞增殖 在以上各組細胞培養至48 h時加入20 μl(5 g/L)的MTT溶液，繼續孵育4 h；棄去多余培養基并加入150 μl DMSO振蕩反應10 min，酶標儀檢測490 nm處吸光度(OD)值。細胞抑制率(%)=(1-實驗組OD值/空白對照組OD值)×100%。每組重復3次。

1.2.4流式細胞術檢測細胞凋亡 用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化各組細胞，離心收集各組細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗2次，加結合緩沖液重懸細胞。依據試劑盒說明書，先后加入Annexin V-FITC和PI避光孵育。流式細胞儀檢測激發波長488 nm和發射波長530 nm處的熒光強度。實驗重復3次。

1.2.5qRT-PCR檢測IL-6、STAT3和VEGF基因表達水平 收集各組細胞，研磨充分后加入Trizol試劑提取總RNA，微量核酸測定儀檢測RNA純度和濃度。使用TaKaRa反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA，按照TaKaRa 熒光定量試劑盒使用說明配制反應體系，以β-actin為內參進行PCR擴增，每個樣品重復3次，循環條件為95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個循環；60℃延長5 min。相對表達量采用2-△△Ct法計算。

1.2.6Western印跡檢測蛋白表達 收集各組細胞，加入RIPA裂解液裂解，4℃，12 000 r/min離心15 min，收集蛋白上清液，BCA試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品進行SDS-PAGE后轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h。分別加入一抗(1∶1 000)，4℃孵育過夜，Tris鹽吐溫緩沖液(TBST)洗膜；加入二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min，后在暗室中曝光顯影，再浸入定影，最后洗去殘液晾干，將膠片用Quantity One凝膠分析軟件處理，測定各組蛋白條帶的吸光度，以目的條帶和β-actin條帶的比值作為蛋白表達水平。每個蛋白樣品重復3次。

1.2.7酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測IL-6的含量 以上各組細胞離心取上清，按照ELISA試劑盒說明書進行操作。

1.2.8統計學分析 采用SPSS20.00軟件進行t檢驗，方差分析。

2 結 果

2.1不同濃度的毛鉤藤堿對結直腸癌細胞增殖的抑制作用 與DMSO組相比，TAX 5 mg/L組結直腸癌細胞的抑制率顯著升高，與DMSO組和TAX 5 mg/L組相比，不同濃度毛鉤藤堿處理組結直腸癌細胞的抑制率逐漸顯著升高，呈濃度依賴型(均P<0.05)。見表1。

表1 不同濃度的毛鉤藤堿作用不同時間抑制結直腸癌細胞增殖及CyclinD1、MMP2和Caspase-3表達

2.2不同濃度的毛鉤藤堿對結直腸癌細胞凋亡的誘導作用 NC組凋亡率為〔(4.23±0.35)%〕,與DMSO組〔(7.61±0.62)%〕比較，TAX 5 mg/L組結直腸癌細胞的凋亡率〔(13.83±0.93)%〕顯著升高，與DMSO組和TAX 5 mg/L組比較，不同濃度毛鉤藤堿處理組結直腸癌細胞的凋亡率逐漸顯著升高，呈濃度依賴型〔毛鉤藤堿150 μmol/L組(12.43±0.73)%、300 μmol/L組(15.73±1.08)%、600 μmol/L組(26.48±1.28)%，均P<0.05〕。見圖1。

圖1 流式細胞儀檢測結直腸癌細胞凋亡率

2.3不同濃度的毛鉤藤堿對結腸癌細胞中細胞周期蛋白(Cyclin)D1、基質金屬蛋白酶(MMP)2和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3表達的影響 與DMSO組比較，TAX 5 mg/L組、毛鉤滕堿各濃度組結直腸癌細胞中CyclinD1、MMP2表達水平顯著降低，Caspase-3表達水平顯著升高(均P<0.05)；與TAX 5 mg/L組比較，毛鉤藤堿300、600 μmol/L組結直腸癌細胞中CyclinD1、MMP2表達水平顯著降低，Caspase-3表達水平顯著升高，呈濃度依賴型(均P<0.05)。見表1，圖2。

1～6：NC組、DMSO組、毛鉤藤堿150 μmol/L組、毛鉤藤堿300 μmol/L組、毛鉤藤堿600 μmol/L組、TAX 5 mg/L組

2.4不同濃度的毛鉤藤堿對結直腸癌細胞遷移和侵襲的抑制作用 與DMSO組比較，TAX 5 mg/L組、毛鉤藤堿各濃度組結直腸癌細胞的遷移和侵襲數量顯著降低(均P<0.05)，與TAX 5 mg/L組相比，毛鉤藤堿300、600 μmol/L組結直腸癌細胞的遷移和侵襲數量逐漸顯著降低，呈濃度依賴型(均P<0.05)。見表2。

表2 不同濃度的毛鉤藤堿抑制結直腸癌細胞遷移和侵襲個)

2.5不同濃度的毛鉤藤堿對結腸癌細胞中IL-6、STAT3和VEGF mRNA表達的影響 與DMSO組比較，TAX 5 mg/L組結直腸癌細胞中IL-6、STAT3和VEGF mRNA的表達水平，但差異無統計學意義(P>0.05),毛鉤滕堿各濃度組IL-6、STAT3、VEGF mRNA表達水平顯著降低(均P<0.05)；與TAX 5 mg/L組比較，毛鉤藤堿300、600 μmol/L組結直腸癌細胞中IL-6、STAT3和VEGF表達水平逐漸顯著降低，呈濃度依賴型(均P<0.05)。見表3。

2.6不同濃度的毛鉤藤堿對結腸癌細胞中IL-6、STAT3、和VEGF蛋白表達的影響 NC組IL-6含量為〔(245.79±36.72)pg/ml〕;與DMSO組〔(236.56±32.54)pg/ml〕比較，TAX 5 mg/L組結直腸癌細胞中IL-6的含量顯著降低〔(175.91±28.34)pg/ml;P<0.05〕；與DMSO組和TAX 5 mg/L組比較，不同濃度毛鉤藤堿處理組結直腸癌細胞中IL-6的含量逐漸顯著降低〔毛鉤藤堿150 μmol/L組(124.87±23.40)pg/ml、300 μmol/L組(73.95±16.41)pg/ml、600 μmol/L組(48.65±14.65)pg/ml，均P<0.05〕。與DMSO組比較，TAX 5 mg/L組、毛鉤藤堿各濃度組結直腸癌細胞中VEGF、STAT3和p-STAT3蛋白表達水平顯著降低(均P<0.05)；與TAX 5 mg/L組比較，毛鉤藤堿300、600 μmol/L組結直腸癌細胞中VEGF、STAT3和p-STAT3蛋白表達水平逐漸降低(均P<0.05)。見表3，圖3。

表3 不同濃度的毛鉤藤堿對結腸癌細胞中IL-6、STAT3和VEGF mRNA、STAT3、VEGF表達的影響

1～6：NC組、DMSO組、毛鉤藤堿150 μmol/L、毛鉤藤堿300 μmol/L組、毛鉤藤堿600 μmol/L組、TAX 5 mg/L

3 討 論

結直腸癌近年來發病率、死亡率逐漸上升，嚴重威脅著人類的健康。新輔助化療治療早期結直腸癌、靶向藥物治療結直腸癌肝轉移療效較好〔7〕。而且研究表明，中醫藥輔助放化療及手術治療結腸癌患者，能改善患者的預后，提高患者的身體狀況，在治療結腸癌方面發揮著重要的作用〔8〕。毛鉤藤堿是中藥鉤藤的吲哚生物堿，能抑制登革熱病毒生命周期的晚期步驟〔9〕。毛鉤藤堿可下調MMP9蛋白表達水平，在體外抑制缺氧誘導的人乳腺癌MCF-7細胞遷移和侵襲〔6〕。毛鉤藤堿可誘導乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡，可能與其調低Bcl-2/Bax蛋白比值，活化Caspase-9和Caspase-3有關〔10〕。毛鉤藤堿可以抑制人肺癌細胞的生長，通過ROCK1/PTEN/PI3K/GSK3β途徑誘導細胞凋亡〔11〕。本研究中，毛鉤藤堿可抑制結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲，促進其凋亡；還抑制CyclinD1、MMP2蛋白的表達，促進Caspase-3蛋白的表達。

IL-6可以調節細胞增殖分化，炎癥反應和免疫反應等；STAT3是參與信號轉導和轉錄激活的重要轉錄因子，其持續活化與多種腫瘤的發生發展有關；IL-6是STAT3的激活因子，可以活化STAT3，進而促進其下游的信號轉導，而活化的STAT3調控炎性細胞因子的表達，持續活化的IL-6/STAT3可促進腫瘤的發展〔12〕。研究發現IL-6/STAT3通路的高表達可促進耐藥蛋白及抗凋亡蛋白表達，誘導卵巢癌的鉑類耐藥〔13〕。激活IL-6/酪氨酸激酶(JAK)2/STAT3信號通路會增強肺癌細胞的轉移〔14〕。晚期糖基化終末產物(AGEs)能夠通過JAK2/STAT3信號通路促進結腸癌SW480細胞的增殖，抑制凋亡，增強侵襲、遷移能力〔15〕；而阻斷IL-6/STAT3通路，抑制IL-6的生成可以抑制結腸癌的增殖〔16，17〕。本研究結果發現IL-6、STAT3的表達下降時細胞凋亡增多，驗證了IL-6/STAT3與結腸癌的進展相關，且毛鉤藤堿可抑制IL-6、STAT3和VEGF的表達。

越來越多的研究發現，不同的中藥通過IL-6/STAT3通路可以影響不同腫瘤的發生發展。如消癌解毒方通過抑制IL-6/STAT3信號通路，上調Cleaved Caspase-3的表達可以促進腫瘤細胞凋亡〔18〕。白藜蘆醇通過抑制IL-6調節JAK2/STAT3信號通路可誘導伯基特淋巴瘤細胞凋亡〔19〕。馬錢子堿通過抑制IL-6/STAT3信號通路可誘導結腸癌SW480細胞凋亡〔20〕。白花蛇舌草通過抑制STAT3信號通路也可以抑制結腸直腸癌的生長〔21〕。馬齒莧多糖早期調控IL-6/STAT3信號通路能夠降低結腸癌的發病率〔22〕。而本研究結果發現毛鉤藤堿可通過抑制CyclinD1、MMP2蛋白的表達，促進Caspase-3蛋白的表達，從而抑制結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲，促進其凋亡。