大黃酚與轉化生長因子-β1對體外培養人成纖維細胞膠原及盤狀結構域受體2的調控作用及機制

楊成華 巫岳龍 李敏 程基焱 顏麗萍

(1達州職業技術學院，四川 達州 635001；2西南醫科大學；3泰安護理職業技術學院)

成纖維細胞參與修復的整個過程，其分裂、增殖、遷移、合成與分泌細胞外基質，形成結締組織或瘢痕組織、使創傷修復，這是目前醫學理論中組織創傷后修復的主要機制〔1～3〕。細胞外基質中，膠原是最為重要的有形成分，目前已經發現的膠原至少有10多種類型，其中Ⅰ型膠原(Col-Ⅰ)、Ⅲ型膠原(Col-Ⅲ)是最主要成分，是成纖維細胞修復組織創傷過程中的主要角色。研究發現，膠原纖維可以激活盤狀結構域受體(DDR)2，再通過作用于基質金屬蛋白酶(MMPs)降解膠原參與膠原的合成與分泌及細胞外基質重構〔4,5〕。大黃酚是大黃、蘆薈等多種中藥的有效成分。大黃、蘆薈在中國的使用有著悠久的歷史，除了可以用于疾病的辨證施治以外，還用于保健和日用化工品中，對于護發和護膚方面的應用尤為常見〔6～8〕。本研究采用體外培養人成纖維細胞，用大黃酚干擾，檢測成纖維細胞的增殖及對Col-I、Col-Ⅲ、DDR2表達的影響，探討大黃酚對成纖維細胞的影響及機制，為成纖維細胞的功能調控的研究及中藥大黃、蘆薈在臨床的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1細胞來源及主要試劑、設備 人成纖維細胞細胞株：北納生物公司；一抗(膠原、DDR2)：上海信裕生物科技有限公司；Western印跡和聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒：大黃酚：上海寶曼生物科技有限公司；天根生化科技(北京)有限公司；流式細胞儀：美國BD公司。

1.2細胞培養及干擾 將人成纖維細胞株復蘇，用1.0×105/L的細胞濃度接種到培養板，小牛血清10%和DMEM培養基常規培養，待3～4 d后增殖到約70%后換用無血清成纖維細胞培養基培養24 h后進行后續干擾。細胞分為對照組(CG)、TGF組(TTG)、大黃酚組(CTG)。CG常規培養，TTG以5 μg/ml的TGF-β1干擾，CTG分別以二甲基亞砜為溶劑溶解大黃酚稀釋，以200 μg/ml干擾，24 h后終止干擾，進入后續使用。

1.3實時定量(qRT)-PCR檢測DDR2、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的mRNA表達水平 細胞干擾培養48 h后收集細胞，提取細胞總RNA，計算RNA溶液濃度。然后逆轉錄合成cDNA，冰上冷卻，逆轉錄，-20℃保存cDNA。PCR條件：95℃ 30 s 1個循環；60℃ 60 s，40個循環；最后65℃ 15 s。以β-actin作為內參，進行相對定量分析。采用分析軟件Bio.Rad CFXManager自動統計和計算。引物設計：DDR2正義5′-GCAACACGTAGAACTCTACCAGAA-3′，反義5′-CAGCCACTCAGGCGTATCA-3′；Col-Ⅰ正義5′-TGCCGTGACGTGAAGATGTG-3′，反義5′-CACAAGCGTGCTGTAGGTGA-3′；Col-Ⅲ正義5′-ATGGTGGCTTTCAGTTCAGC-3′，反義5′-TGGGGTTTCAGA GAGTTTGG-3′。

1.4Western印跡檢測DDR2、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表達水平 細胞干擾培養48 h后洗滌、收集培養細胞，細胞裂解液4℃，30 min下裂解細胞，移至離心管，4℃ 12 000 r/min，離心5 min，收集上清，-20℃保存。根據試劑盒說明書配制蛋白標準品，酶標儀下波長562 nm比色繪制標準曲線。置樣品放于96孔板，加二喹啉甲酸(BCA)工作液，酶標儀下波長562 nm比色并記錄各孔吸光值，在標準曲線上查得相應蛋白含量。聚丙烯酰胺凝膠蛋白電泳，濃縮膠電泳電流為25 mA，分離膠電泳電流為30 mA，將蛋白轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%去脂牛奶封閉，一抗分別與磷酸鹽緩沖液(PBS)、0.1% Tween-20和5% 去脂牛奶混合，膜放入該混合液中4℃過夜，洗滌后加入二抗，室溫孵育2 h，充分洗滌，曝光，顯影并拍照。Quantity-one軟件分析灰度值，以目的片段的灰度值與相應β-actin灰度值的比作為蛋白質的相對水平?？贵w稀釋度：DDR2(1∶500稀釋)，Col-Ⅰ(1∶400稀釋)，Col-Ⅲ(1∶500稀釋)，二抗(山羊抗小鼠，1∶5 000稀釋；山羊抗兔，1∶5 000稀釋)。

1.5流式細胞儀檢測細胞周期 取干擾24 h后的細胞，胰酶消化，離心后冰乙醇固定。采用5×105/ml的細胞濃度，再用碘化丙啶(PI)染液孵育染色。流式細胞儀(美國 BD公司，型號BD CSCalibur)下，用488 nm波長激光激發，AC Station、Cell QUEST Pro進行細胞周期檢測。

1.6統計學檢驗 采用Graph Pad Prism軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1qRT-PCR檢測DDR2、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的mRNA表達水平 與CG(1.00)比較，TTG、CTG上調成纖維細胞的DDR2 mRNA表達(1.21、1.24)，有顯著性差異(P<0.05)；與CG(1.00)比較，TTG上調成纖維細胞的Col-Ⅰ表達(1.29)，有顯著性差異(P<0.05)；CTG下調成纖維細胞的Col-Ⅰ表達(0.91)，有顯著性差異(P<0.05)；與CG(1.00)比較，TTG略微下調成纖維細胞的Col-Ⅲ表達(0.95)，無顯著性差異(P>0.05)；CTG上調Col-Ⅲ表達(1.08)，有顯著性差異(P<0.05)。

2.2Western印跡檢測DDR2、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表達水平 干擾培養各組細胞24 h后，TTG、CTG的DDR2表達水平(1.217、1.239)與CG(1.000)有統計學差異(P<0.05)；TTG、CTG Col-Ⅰ表達(1.428)與CG(1.000)比較有統計學差異(P<0.05)；TTG的Col-Ⅲ表達(0.981)與CG(1.000)比較無統計學意義(P>0.05)；CTG Col-Ⅲ表達(1.319)與CG比較有顯著性差異(P<0.05)。見圖1。

圖1 Western印跡檢測DDR2、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表達

2.3流式細胞儀細胞周期檢測結果 干擾培養細胞24 h后，TTG G1/G0期細胞所占比例略高于CG，無顯著性差異(P>0.05)；CTG G1/G0期細胞所占比例低于CG，有顯著性差異(P<0.05)；TTG與CG S期細胞所占比例無顯著性差異(P>0.05)，CTG S期細胞所占比例高于對照組，有顯著性差異(P<0.05)；各組G2期細胞所占比例無明顯差異(表1)。

表1 各組流式細胞儀細胞周期檢測結果

3 討 論

組織創傷后的修復是極為復雜的問題，成纖維細胞外基質內的膠原是其主要的參與成分，尤其以Col-Ⅰ、Col-Ⅲ為主。組織創傷修復后有大量瘢痕產生，影響了皮膚的美觀，甚至因為瘢痕的收縮、粘連從而影響了器官功能。有研究發現，胚胎皮膚創傷修復“無瘢痕愈合”〔9〕。研究表明，創傷無瘢痕愈合的主要機制之一是Col-Ⅲ在細胞外基質中含量增高和(或)與Col-Ⅰ的比例增高〔4～6〕。

TGF-β是一類分泌型多肽細胞因子，可以調節成纖維細胞合成及分泌功能，協調創傷愈合，加速細胞外基質的合成及沉淀。因此，有學者認為TGF-β1參與膠原的產生、促進創傷愈合，甚至是導致瘢痕產生的主要機制〔10〕。DDR可以和膠原蛋白結合，參與炎癥、創傷修復等過程。研究表明，DDR2可以被膠原激活，再作用于MMPs，進一步降解膠原。因此，Col-DDRs-MMPs之間的相互作用存在一個正反饋環路，參與組織創傷修復，膠原降解、膠原排列及細胞外基質重構〔11～14〕。TGF-β1可以明顯通過促進Col-Ⅰ的分泌而促進組織創傷愈合，但大黃酚卻對Col-Ⅰ的合成及分泌功能有抑制作用。

從TGF-β1和大黃酚對DDR2表達的影響結果來看，二者下調了DDR2的合成與表達。TGF-β1促進Col-Ⅰ的合成與分泌可能是參與組織創傷修復的作用機制，即增加細胞外基質的產生而達到促進修復的作用。TGF-β1導致Col-I分泌的增多則可能上調了DDR2表達，再進一步降解Col-Ⅰ。大黃酚的作用則可能是直接上調DDR2表達，進一步降解Col-Ⅰ，同時促進Col-Ⅲ合成，從而增高Col-Ⅲ/Col-Ⅰ的比例，則有可能降低瘢痕產生的可能性。

本實驗結果說明成纖維細胞的分裂增殖活性增加。大黃酚促使成纖維細胞的增殖活性增加則說明細胞的數量增加較快，有利于產生較多的細胞外基質，有利于組織創傷的修復〔13～15〕。結合上述大黃酚對Col-Ⅲ、Col-Ⅰ表達的調控作用，大黃酚雖然抑制成纖維細胞Col-Ⅰ的表達，但是可以增加成纖維細胞的增殖活性，從而促進組織創傷的修復。同時大黃酚促進Col-Ⅲ的表達，則可能通過該機制促進創傷修復的同時，減少瘢痕的形成。