不同劑量肝素對老年膿毒癥大鼠腸道功能的影響

鞏固 王瑩 趙廣明 胡占升

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，遼寧 錦州 121000)

膿毒癥是由嚴(yán)重感染引起宿主反應(yīng)失調(diào)的全身炎癥反應(yīng)(SIRS)，亦是引發(fā)多器官功能障礙綜合征(MODS)的最主要原因〔1〕。而在多個器官功能中，膿毒癥時最早累及腸道〔2〕，當(dāng)腸道損傷時，其通透性增加，腸屏障功能受損，腸道細(xì)菌及毒素進入循環(huán)系統(tǒng)，導(dǎo)致多種炎癥介質(zhì)釋放，引發(fā)和加重失控性炎癥反應(yīng)綜合征〔3〕，保護腸道功能可以減輕膿毒癥導(dǎo)致的MODS，降低膿毒癥休克的病死率。老年人群是膿毒癥的高發(fā)病人群，肝素作為常用抗凝劑，可以改善膿毒癥時凝血異常，抑制彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)的發(fā)生發(fā)展〔4〕。研究表明肝素具有一定的抗炎作用，可改善膿毒癥患者的微循環(huán)障礙及 MODS所造成的不良影響〔5～8〕。在以往的研究中，關(guān)于不同劑量肝素對膿毒癥腸道功能的影響的研究較少，本研究觀察不同劑量的肝素對老年膿毒癥大鼠腸道的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑 戊巴比妥鈉粉劑(5 g，美國Sigma公司)，肝素鈉注射液(2 ml∶12 500 U，常州千紅生化制藥股份有限公司)，血D-乳酸(Lac)白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6和腫瘤壞死因子(TNF)-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，Western印跡試劑及抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)，Tunel試劑盒(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)。

1.2實驗動物及分組 清潔級健康老年雄性SD大鼠(20～24個月)，體重200～250 g 60只，購于錦州醫(yī)科大學(xué)動物房，大鼠飼養(yǎng)于清潔鼠籠中，溫度22～26℃，每日照明時間10 h，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由攝食攝水，喂養(yǎng)1 w后活動正常納入該實驗，60只老鼠按隨機數(shù)字法隨機分為5組，每組12只，分別為假手術(shù)(Sham)組、盲腸結(jié)扎穿刺(CLP)組、低劑量肝素(L)組、中劑肝素(M)組、高劑量肝素(H)組。

1.3膿毒癥大鼠造模及給藥 采用CLP法造模，在兩個連續(xù)日的上午由同一組人員(3人)完成，術(shù)前大鼠禁食12 h，自由飲水，用1%戊巴比妥鈉50 mg/kg進行麻醉，麻醉滿意后，將大鼠仰臥固定，剪毛，安爾碘消毒，鋪巾，沿腹部中線剪開皮膚4～5 cm，剪開肌肉腹膜后牽出盲腸，測量盲腸全長后在距盲腸遠(yuǎn)端1/2處以1號無菌絲線結(jié)扎盲腸，結(jié)扎后用12號針頭在盲腸結(jié)扎的中間位置全層穿透，并輕擠出少許糞便，確保穿刺孔通暢。盲腸還納回腹腔，逐層縫合腹壁。Sham組只暴露盲腸，不結(jié)扎穿孔。術(shù)畢L組、M組、H組分別皮下注射肝素100 IU/kg、200 IU/kg、250 IU/kg每4 h 1次，Sham組及CLP組皮下注射等劑量的生理鹽水。大鼠送回原籠，大約2 h后麻醉復(fù)蘇。本實驗中動物處置方法符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.4檢測指標(biāo)及方法 ①術(shù)后24 h所有大鼠取頸靜脈血，全血離心5 min取上清血，-20℃凍存?zhèn)溆茫龢?biāo)本全部收集后用ELISA測定血D-Lac IL-1β、IL-6、TNF-α水平，操作嚴(yán)格按照試劑盒的說明書進行。②取血后頸動脈放血處死全部大鼠，取回腸組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定、脫水，透明、石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅(HE)染色后光鏡下觀察各組大鼠腸組織病理性形態(tài)學(xué)變化；然后參照Chiu等〔9〕報道的方法進行腸組織損傷評分(Chiu6級評分標(biāo)準(zhǔn))：0分：結(jié)構(gòu)正常；1分腸黏膜絨毛頂端上皮下間隙增寬；2分：絨毛尖端上皮太高與固有層剝離；3分：絨毛兩側(cè)上皮成塊脫落；4分上皮完全脫落，僅存固有層結(jié)構(gòu)；5分：黏膜固有層崩解、出血和潰瘍。③Western印跡法測定腸道組織緊密連接蛋白Occludin，炎性蛋白核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB，通路蛋白TLR4的表達(dá)水平。將回腸組織稱重剪成細(xì)小碎片并勻漿，取40 μg總蛋白按1∶4 體積比加入5×樣品緩沖液，于沸水浴中煮5 min使蛋白變性。將處理好的樣品按照預(yù)定的順序加入濃縮膠的上樣孔內(nèi)進行電泳，轉(zhuǎn)膜、用脫脂奶粉封閉，室溫振蕩60 min。一抗孵育4℃過夜，洗膜后，加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗孵育，置于X光中顯影，用IPP軟件對掃描圖像的目的條帶進行灰度分析。④Tunel法測定腸道凋亡率：采用Tunel法檢測回腸黏膜細(xì)胞凋亡情況，每組內(nèi)每張切片隨機選5個視野進行拍照，凋亡細(xì)胞核呈棕褐色，藍(lán)色為細(xì)胞核為陰性對照，陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)為凋亡率。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行SNK-q檢驗、t檢驗、秩和檢驗。

2 結(jié) 果

2.1一般性觀察 各組大鼠術(shù)后2 h逐漸蘇醒。4～6 h后除Sham組外,其他各組大鼠均出現(xiàn)活動減少,反應(yīng)遲鈍,眼周分泌物增多,停止攝食攝水等癥狀。12 h后 L組、M組、H組大鼠較CLP組癥狀有所改善，H組在12 h后開始少量攝水，少量活動，發(fā)紺減輕。

2.2各組血D-Lac比較 與Sham組相比，其他各組氧分壓(PO2)值均顯著下降，D-Lac含量均顯著升高(P<0.05)；與CLP組相比，L、M、H組PO2值顯著升高，D-Lac含量均顯著下降(P<0.05)；L 組、M 組、H 組兩兩比較PO2、D-Lac含量最差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組血氣分析及D-Lac的比較

2.3各組IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較 與Sham組相比，其他各組IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)；與CLP組對比，L 組、M 組、H 組IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)水平均顯著下降(P<0.05)；L 組、M 組、H 組兩兩比較IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較

2.4回腸組織病理學(xué)觀察及Chiu評分比較 與Sham組比較，其他各組腸道黏膜病理學(xué)損傷程度均顯著加重(P<0.05)；與CLP組比較，L組、M組、H組腸道黏膜病理學(xué)損傷程度顯著減輕(P<0.05)；L組、M組、H組腸道黏膜病理學(xué)損傷程度依次減弱，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1，表3。

表3 各組Chiu評分及凋亡率比較

2.5各組Occludin、TLR4、NF-κB表達(dá)比較 與Sham組比較，其他各組Occludin表達(dá)顯著下降，TLR-4、NF-κB表達(dá)顯著上升(P<0.05)；與CLP組比較，L 組、M 組、H 組Occludin表達(dá)顯著上升，TLR-4、NF-κB表達(dá)顯著下降(P<0.05)；L 組、M 組、H 組兩兩比較Occludin、TLR-4、NF-κB差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2、表4。

表4 各組Occludin、TLR-4、NF-κB蛋白相對表達(dá)水平比較

圖2 Western印跡法測定Occludin、TLR-4、NF-κB蛋白表達(dá)

2.6回腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡率比較 與Sham組比較，其他各組回腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05)；與CLP組比較，L組、M組、H組凋亡率顯著降低(P<0.05)；L組、M組、H組組間比較，凋亡率依次下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3、圖3。

圖3 回腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡情況(Tunel，×200)

3 討 論

老年人群是膿毒癥的高發(fā)人群，文獻(xiàn)報道年齡是影響膿毒癥發(fā)病和嚴(yán)重程度的獨立風(fēng)險因素，每增加10歲，其發(fā)病率呈指數(shù)冪增長，65歲以上的老年患者的發(fā)病率是65歲以下的13.1倍〔10〕。膿毒癥發(fā)生最早累及腸道，1986年Meakins等〔11〕提出“胃腸道是MODS的始動器官”的著名論點，腸道作為機體應(yīng)激的重要器官，作為人體的“儲菌庫”和“內(nèi)毒素庫”在膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展中扮演著非常重要的角色。當(dāng)腸道損傷時，其通透性增加，腸屏障功能受損，微血栓形成及發(fā)生相關(guān)的微循環(huán)障礙，加劇腸上皮細(xì)胞的凋亡〔12，13〕，同時又會通過腸道內(nèi)細(xì)菌及毒素移位刺激TNF-α、IL-1β、IL-6等大量炎癥介質(zhì)的大量釋放導(dǎo)致其他重要器官功能障礙，甚至衰竭，是MODS的始動器官〔14〕。因此保護腸道功能是降低老年膿毒癥病死率的關(guān)鍵。當(dāng)腸黏膜受損時，其通透性顯著上升，同時產(chǎn)道內(nèi)病原微生物大批量生長繁殖，腸道內(nèi)細(xì)菌進行無氧酵解的產(chǎn)物D-Lac增加，D-Lac可以通過損傷的腸黏膜進入血液導(dǎo)致血D-Lac水平升高，因此測定血漿D-Lac水平可以反映腸黏膜損傷情況，動物試驗研究表明腸黏膜損傷與血中的D-Lac含量呈正相關(guān)。腸黏膜的機械屏障主要以上皮細(xì)胞，絨毛及血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接(TJ)組成〔15〕，而Occludin蛋白是TJ形成的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，在緊密連接的縫隙處起著結(jié)構(gòu)性作用，它的缺失可以直接導(dǎo)致緊密連接結(jié)構(gòu)的完整性失效〔16〕，在膿毒癥的研究中發(fā)現(xiàn)，腸上皮通透性的顯著增加及Occludin表達(dá)減少，導(dǎo)致細(xì)菌的異位及敗血癥死亡率增加〔17〕。腸道完整性異常，腸上皮細(xì)胞凋亡增加，在膿毒癥模型中，腸上皮細(xì)胞凋亡的增加與死亡率的增加有關(guān)〔18〕。

本研究顯示肝素干預(yù)后的老年膿毒癥大鼠的血Lac明顯降低，腸黏膜Occludin蛋白明顯升高，并且與肝素應(yīng)用的劑量有相關(guān)性。本研究還顯示，模型老年大鼠腸黏膜結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著炎性滲出、壞死等病理改變，腸壁上皮細(xì)胞有較多凋亡，但肝素可顯著減輕這些病理改變，且H組較M組降低程度更顯著，提示肝素能阻止膿毒癥所導(dǎo)致的腸黏膜病變，且這一作用與肝素的劑量呈正比。

膿毒癥發(fā)生時，先天性免疫啟動以防御病原微生物入侵，Toll樣受體(TLRs)是病原體入侵的首道防線〔19，20〕，TLRs能識別外來病原體，傳遞下游信號，介導(dǎo)炎癥因子的生成，其中TLR4是腸道固有免疫系統(tǒng)的重要成員，能識別革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要成分〔21〕，觸發(fā)了下游多條信號通路的激活，其中NF-κb的激活最為關(guān)鍵，使TNF-α，IL-1β，IL-6等生成增加，炎癥介質(zhì)又一步促進TLR4的表達(dá)，使受體與炎癥介質(zhì)之間形成一個正反饋環(huán)，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)不斷擴大〔22,23〕。本研究顯示肝素干預(yù)后的老年膿毒癥大鼠的炎癥指標(biāo)明顯下降，并且與肝素應(yīng)用的劑量有相關(guān)性。

關(guān)于實驗中肝素劑量的選擇出于以下考慮：①有研究顯示健康成年SD大鼠活化凝血時間(ACT)的均值為48 s，遠(yuǎn)小于人類正常值(70～130 s)，大鼠達(dá)到同等抗凝水平所需要每公斤體重肝素劑量遠(yuǎn)高于人類，如使SD大鼠ACT達(dá)480 s并維持30 min需要單劑靜脈注射肝素1 200 IU/kg〔24〕；②以成人(老年)急性肺栓塞所用肝素緊急抗凝的經(jīng)驗劑量500 IU/kg為參照，根據(jù)不同種屬用藥劑量換算公式可以換算為300 g大鼠所需劑量為2 000 IU/kg〔25〕；③有研究發(fā)現(xiàn)肝素150～300 IU/kg可以減少燒傷大鼠腸黏膜細(xì)胞凋亡和腸細(xì)菌移〔26〕；④在預(yù)實驗中給予300 IU/kg皮下注射，24 h解剖大鼠時發(fā)現(xiàn)有組內(nèi)大部分大鼠腹腔出血的情況，基于以上采用100 IU/kg、200 IU/kg、250 IU/kg 3個檔次的肝素進行干預(yù)。

綜上所述，肝素治療對老年膿毒癥大鼠的腸道功能具有一定保護作用，且與肝素應(yīng)用的劑量相關(guān)，其機制可能與其增加腸道Occludin蛋白的表達(dá)，降低TOLL通路TLR4、NF-κB的表達(dá)從而減少炎癥介質(zhì)IL-1、IL-6、TNF-α及腸道上皮細(xì)胞凋亡。